【答案】应助回帖

曾文正公

金虫 (著名写手)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 4564.3
红花: 6
帖子: 1936
在线: 626.5小时
虫号: 2161228
注册: 2012-12-02
性别: GG
专业: 神经生物学

★ ★ ★
xiehe018(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-25 13:34:42

这么短的片段有这么多突变缺失一定得用高保真酶了像primeStar 至于你说用高保真酶扩不出来我觉得可能是因为：1.目的基因的表达丰度太低，建议换一个目的基因表达量高的cDNA做模板。2. 引物设计的问题引物的GC含量怎么样？加的哪个酶的酶切位点？加保护碱基了吗？加了多少个？想到的就这些祝楼主好运

只有非常努力，才能看起来毫不费力

12楼2014-06-25 10:48:33

a50044758

银虫 (小有名气)

应助: 27 (小学生)
金币: 599.2
散金: 5
红花: 2
帖子: 262
在线: 189.9小时
虫号: 1301494
注册: 2011-05-20
性别: GG
专业: 蛋白质组学

引用回帖:

9楼: Originally posted by xiehe018 at 2014-06-25 09:45:07
我还想要问一下，你用的是Phusion DNA Polymerase吗？那PCR enhancer buffer用普通的buffer行吗？还有dNTP等都各加多少量呀？麻烦你把你用的体系发给我一下呗！谢谢啦！
...

就是正常的PCR体系，说明书里面有，你可以看说明书，如果弄丢了去网上下一个。http://www.thermoscientificbio.c ... ity-pcr-master-mix/

13楼2014-06-25 10:56:32

a50044758

银虫 (小有名气)

应助: 27 (小学生)
金币: 599.2
散金: 5
红花: 2
帖子: 262
在线: 189.9小时
虫号: 1301494
注册: 2011-05-20
性别: GG
专业: 蛋白质组学

【答案】应助回帖

★ ★
xiehe018(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-25 13:34:56

引用回帖:

就是正常的PCR反应体系，网上有说明书的。http://www.thermoscientificbio.c ... ity-pcr-master-mix/
照着说明书配体系就行。

14楼2014-06-25 10:57:45

54808455

新虫 (初入文坛)

应助: 6 (幼儿园)
金币: 0.4
帖子: 33
在线: 29.4小时
虫号: 541223
注册: 2008-04-07
性别: GG
专业: 植物学研究的新技术、新方

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiehe018(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-25 13:35:06

两个问题
1.扩增用的模板是什么？基因组还是cDNA？举个例子：克隆陆地棉基因（异源四倍体），基因就有可能存在4种序列（存在SNP)。
2.PrimeSTAR扩增效率还行，一般都能扩增出来，换下质量好的模板试一试。
还不行的话，换下pfuUltra II Fusion HS DNA polymerase。

15楼2014-06-25 10:58:58