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xiehe018

禁虫 (小有名气)
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11楼2014-06-25 10:17:41
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曾文正公

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
xiehe018(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-25 13:34:42
这么短的片段有这么多突变 缺失一定得用高保真酶了  像primeStar  至于你说用高保真酶扩不出来  我觉得可能是因为：1.目的基因的表达丰度太低，建议换一个目的基因表达量高的cDNA做模板。2. 引物设计的问题  引物的GC含量怎么样？加的哪个酶的酶切位点？加保护碱基了吗？加了多少个？  想到的就这些  祝楼主好运   
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只有非常努力，才能看起来毫不费力
12楼2014-06-25 10:48:33
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a50044758

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xiehe018 at 2014-06-25 09:45:07
我还想要问一下，你用的是Phusion DNA Polymerase吗？那PCR enhancer buffer用普通的buffer行吗？还有dNTP等都各加多少量呀？麻烦你把你用的体系发给我一下呗！谢谢啦！
...

就是正常的PCR体系，说明书里面有，你可以看说明书，如果弄丢了去网上下一个。http://www.thermoscientificbio.c ... ity-pcr-master-mix/
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13楼2014-06-25 10:56:32
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a50044758

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
xiehe018(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-25 13:34:56
引用回帖:
9楼: Originally posted by xiehe018 at 2014-06-25 09:45:07
我还想要问一下，你用的是Phusion DNA Polymerase吗？那PCR enhancer buffer用普通的buffer行吗？还有dNTP等都各加多少量呀？麻烦你把你用的体系发给我一下呗！谢谢啦！
...

就是正常的PCR反应体系，网上有说明书的。http://www.thermoscientificbio.c ... ity-pcr-master-mix/
照着说明书配体系就行。
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14楼2014-06-25 10:57:45
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54808455

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiehe018(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-25 13:35:06
两个问题
1.扩增用的模板是什么？基因组还是cDNA？举个例子：克隆陆地棉基因（异源四倍体），基因就有可能存在4种序列（存在SNP)。
2.PrimeSTAR扩增效率还行，一般都能扩增出来，换下质量好的模板试一试。
还不行的话，换下pfuUltra II Fusion HS DNA polymerase。
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15楼2014-06-25 10:58:58
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xiehe018

禁虫 (小有名气)
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16楼2014-06-25 11:03:16
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xiehe018

禁虫 (小有名气)
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17楼2014-06-25 11:03:51
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a50044758

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by xiehe018 at 2014-06-25 11:03:51
哦，你是用的Mastermix呀！
...

我用的不是mix，发错你了，我建议你用国产的若唯赞的phanta高保真酶，效果比phusion好些。
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18楼2014-06-25 11:37:04
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匿名

用户注销 (著名写手)
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19楼2018-07-28 16:04:36
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