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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR的问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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playboy723

金虫 (正式写手)

[交流] PCR的问题

请教各位：
我最近要构建一个载体，大概有1500bp左右，然后我用普通的Tag酶可以扩得出来，可是我用高保真的exTaq酶扩时却怎么也扩不出来，连内参GAPDH也扩不出来，我可以确定模板没有问题，请问各位遇到过这样的问题吗？我该怎么办？继续用普通Taq扩？可这样的错配会很多，即使连到载体上后续的测序也会很麻烦的，求教了。
为什么普通Taq酶可以扩出来而exTag反而扩不出来呢   请赐教  谢谢！！
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1楼 2008-03-27 09:15:03
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weiwei1

木虫 (小有名气)
★
asr(金币+1,VIP+0):thank u!
1500bp,错配也不至于很多吧.个人认为还是体系的问题
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2楼2008-03-27 09:27:41
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碧荷叶

铜虫 (初入文坛)
你用过Pfu酶吗？也是一种高保真PCR用酶。它有外切酶活性，会降解引物，引物要加大用量。你的exTaq有外切酶活性吗？个人认为可以试一下加大引物量。
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3楼2008-03-27 09:38:39
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
asr(金币+1,VIP+0):thank u! 欢迎常来o(∩_∩)o...
Taq的错配几率大概是千分之一吧，所以1500bp的片段可能会出现错配的碱基。如果用高保真酶扩不出来的话，就用Taq试试吧。有些时候就是这样，酶都是挺变态的东西。注意3·加A的问题。最好还是继续优化条件。
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金币是赌出来的
4楼2008-03-27 13:28:04
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playboy723

金虫 (正式写手)
是  我是要连到T载体上的  所以有些种类的高保真酶还不能用，很郁闷，所以还是倾向于继续用exTaq酶。我就想请教一下大家有遇到这种情况的吗  如果有该怎么办呢？
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5楼2008-03-27 15:10:20
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
换个新的吧，可能你的酶本身就有问题。
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6楼2008-03-27 15:14:43
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gyxleo

铜虫 (初入文坛)
★
asr(金币+1,VIP+0):这么做过吗？效果明显？
建议两种酶同时用，rTaq：pfu为1：3或者1：4，用pfu的buffer即可。
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追求卓越，尽善尽美，不断完善自己。
7楼2008-03-27 22:21:45
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playboy723

金虫 (正式写手)
呵呵  6楼得主意很好，我得试试   呵呵 谢谢啊
以前你这样做过吗？很有开创性的主意啊！！！
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8楼2008-03-28 10:03:55
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glenn_007

木虫 (小有名气)
有没有人用两种酶试试啊
很期待这个想法的结果
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9楼2008-03-29 16:15:07
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sunbinice

银虫 (初入文坛)
6楼的你这样做过？想试试啊呵呵呵
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10楼2008-03-29 18:35:13
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