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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 想检测一个大约4kD 的小肽片段，western blot 一直没有条带怎么办
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
另外，在小肽做SDS-PAGE可以加大缓冲溶液的摩尔浓度，并且用三羟甲基甘氨酸代替甘氨酸作为终止离子，浓度可先不变，还可以把分离胶的交联度C增加到增加到10%，这样应该可以顺利。
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11楼2014-07-07 22:28:16
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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youlinglyw: 金币+5, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-07-08 10:46:18
我刚又看了一下楼主的帖子，补充一些提示。

我上面是说的是针对SDS PAGE的，下面也提示一些小分子多肽转膜的注意几点：
1.小于10KD的分离胶用15%-20%，分离胶太稀，阻滞不了小肽，电泳完了，小肽也跑没有了；
2.转移buffer中加入终浓度为20%的甲醇；
3.转膜时间适当短一些，你对于4KD肽转了90分钟，时间过了，一般中等蛋白质电转膜时，60-80V也就是60-90min，你该把电压降低，而且时间太过了，就是分离胶浓度够大，SDS-PAGE成功，带你转膜时，小肽可能也跑没有了。
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12楼2014-07-07 23:08:09
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主的WB实验的电转膜非要用100v，那么一般也就转15-30min就够了。
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13楼2014-07-07 23:34:39
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
SDS-PAGE electrophoresis一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质），当然不同的人的操作可能上样量差异较大。
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14楼2014-07-07 23:48:43
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
又没有人理我了。。。，我是说对了，还是没有说对，给个评论嘛。

有些时候，我的脾气是很大，但一般那是因为对我的反驳，完全违背基本的实验原理，而且我即使当时是这样认为的，事后我发现自己错了，也会坦率承认错误。
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15楼2014-07-07 23:53:23
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wangxueflower

木虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-08 00:08:09
我刚又看了一下楼主的帖子，补充一些提示。

我上面是说的是针对SDS PAGE的，下面也提示一些小分子多肽转膜的注意几点：
1.小于10KD的分离胶用15%-20%，分离胶太稀，阻滞不了小肽，电泳完了，小肽也跑没有了；
...

谢谢啦，给了这么多好的建议，我想问下，小肽转膜时是不是有转过的现象啊，我也请教过其他人，有人说膜只是起到吸收的作用，一般不会透转的，您怎么看呢？
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花开花落，云卷云舒
16楼2014-07-08 08:50:44
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
16楼的问题我没有具体研究过，不过从电磁学角度讲，既然在电场环境下，离子肯定不可能是静止的，电压高本身，带有电荷的多肽就运动得快，时间长的话，应该是有可能从膜上进入溶液中。因为任何的网格的机械阻滞作用也不可能是100%，对于小肽，这样的机械机械阻滞作用只会更小。

从一般性的WB操作protocols来看，结合操作对象是小肽，楼主的实验操作确有些不够规范之处。
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17楼2014-07-08 10:00:52
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wangxueflower

木虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-08 00:48:43
SDS-PAGE electrophoresis一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质），当然不同的人的操作可能上样量差异较大。

上样是不是有点少啊，内参的话没问题，一些表达量少的蛋白质2-10ug 好像有点少了，像我现在的一个蛋白质的剪切产物，10ug 估计不可以吧
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花开花落，云卷云舒
18楼2014-07-08 12:28:25
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
上样量没有一定之规，你可以在多上些样，只要SDSPAGE没有涂带，应该问题不大。
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19楼2014-07-08 16:51:11
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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引用回帖:
18楼: Originally posted by wangxueflower at 2014-07-08 12:28:25
上样是不是有点少啊，内参的话没问题，一些表达量少的蛋白质2-10ug 好像有点少了，像我现在的一个蛋白质的剪切产物，10ug 估计不可以吧...

关键是优化凝胶和电泳液及电泳时间、电压，不然你的样品分子量仅为4KD，加样再多也会漏光的。
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20楼2014-07-09 00:33:42
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