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凌波丽

专家顾问 (知名作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
另外,在小肽做SDS-PAGE可以加大缓冲溶液的摩尔浓度,并且用三羟甲基甘氨酸代替甘氨酸作为终止离子,浓度可先不变,还可以把分离胶的交联度C增加到增加到10%,这样应该可以顺利。
11楼2014-07-07 22:28:16
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
youlinglyw: 金币+5, 赠人玫瑰手有余香,生物科学有你更精彩! 2014-07-08 10:46:18
我刚又看了一下楼主的帖子,补充一些提示。

我上面是说的是针对SDS PAGE的,下面也提示一些小分子多肽转膜的注意几点:
1.小于10KD的分离胶用15%-20%,分离胶太稀,阻滞不了小肽,电泳完了,小肽也跑没有了;
2.转移buffer中加入终浓度为20%的甲醇;
3.转膜时间适当短一些,你对于4KD肽转了90分钟,时间过了,一般中等蛋白质电转膜时,60-80V也就是60-90min,你该把电压降低,而且时间太过了,就是分离胶浓度够大,SDS-PAGE成功,带你转膜时,小肽可能也跑没有了。
12楼2014-07-07 23:08:09
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
楼主的WB实验的电转膜非要用100v,那么一般也就转15-30min就够了。
13楼2014-07-07 23:34:39
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

SDS-PAGE electrophoresis一般上样体积为10-15μL(即2-10μg蛋白质),当然不同的人的操作可能上样量差异较大。
14楼2014-07-07 23:48:43
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

又没有人理我了。。。,我是说对了,还是没有说对,给个评论嘛。

有些时候,我的脾气是很大,但一般那是因为对我的反驳,完全违背基本的实验原理,而且我即使当时是这样认为的,事后我发现自己错了,也会坦率承认错误。
15楼2014-07-07 23:53:23
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wangxueflower

木虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-08 00:08:09
我刚又看了一下楼主的帖子,补充一些提示。

我上面是说的是针对SDS PAGE的,下面也提示一些小分子多肽转膜的注意几点:
1.小于10KD的分离胶用15%-20%,分离胶太稀,阻滞不了小肽,电泳完了,小肽也跑没有了;
...

谢谢啦,给了这么多好的建议,我想问下,小肽转膜时是不是有转过的现象啊,我也请教过其他人,有人说膜只是起到吸收的作用,一般不会透转的,您怎么看呢?
花开花落,云卷云舒
16楼2014-07-08 08:50:44
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
16楼的问题我没有具体研究过,不过从电磁学角度讲,既然在电场环境下,离子肯定不可能是静止的,电压高本身,带有电荷的多肽就运动得快,时间长的话,应该是有可能从膜上进入溶液中。因为任何的网格的机械阻滞作用也不可能是100%,对于小肽,这样的机械机械阻滞作用只会更小。

从一般性的WB操作protocols来看,结合操作对象是小肽,楼主的实验操作确有些不够规范之处。
17楼2014-07-08 10:00:52
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wangxueflower

木虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-08 00:48:43
SDS-PAGE electrophoresis一般上样体积为10-15μL(即2-10μg蛋白质),当然不同的人的操作可能上样量差异较大。

上样是不是有点少啊,内参的话没问题,一些表达量少的蛋白质2-10ug 好像有点少了,像我现在的一个蛋白质的剪切产物,10ug 估计不可以吧
花开花落,云卷云舒
18楼2014-07-08 12:28:25
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
上样量没有一定之规,你可以在多上些样,只要SDSPAGE没有涂带,应该问题不大。
19楼2014-07-08 16:51:11
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)


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引用回帖:
18楼: Originally posted by wangxueflower at 2014-07-08 12:28:25
上样是不是有点少啊,内参的话没问题,一些表达量少的蛋白质2-10ug 好像有点少了,像我现在的一个蛋白质的剪切产物,10ug 估计不可以吧...

关键是优化凝胶和电泳液及电泳时间、电压,不然你的样品分子量仅为4KD,加样再多也会漏光的。
20楼2014-07-09 00:33:42
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