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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)

[求助] 点突变PCR已有2人参与

最近在做点突变PCR，单个突变点，在第一步PCR就失败了。。按照引物Tm-5℃的退火温度（60℃）跑胶结果是弥散的带如图靠左2-7泳道。。模板是质粒，跑胶鉴定没降解；引物在突变点的5‘端有大于15bp，突变点的3’端大概8bp，不加模板P出来也只有引物二聚化的条带；然后PCR试过梯度退火温度，55-70℃，3℃一个梯度，其中55、58、61、64℃就有弥散的带，67、70℃没有条带（只有引物二聚化）；用的是fastpfu酶。。。

求解答><。。。点突变PCR
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1楼2014-06-06 21:47:15
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)
木有回复好伤心&#128532;

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-06-07 08:57:36
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liug268

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-06-08 11:18:40
我建议的方法是PCR桥接法，让第一段片段的下游引物（诱变引物）和第二段片段的上游引物（诱变引物）重合，然后进行整个片段的PCR，之后再酶切连接到质粒载体里面。
用质粒直接扩增难度比较大，而且在不知道序列的情况下很难说会不会存在高GC或高能量引物dimer的情况，或者你可以加点DMSO试试？
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3楼2014-06-07 10:32:56
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by liug268 at 2014-06-07 10:32:56
我建议的方法是PCR桥接法，让第一段片段的下游引物（诱变引物）和第二段片段的上游引物（诱变引物）重合，然后进行整个片段的PCR，之后再酶切连接到质粒载体里面。
用质粒直接扩增难度比较大，而且在不知道序列的情 ...

我用的就是这个方法，即在第一次PCR P第一段的时候就P不出来了。。然后基因的序列是知道的，以前用质粒做模板都挺好P的。。
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4楼2014-06-07 14:41:14
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liug268

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
ashleyoo00: 金币+5, ★有帮助 2014-06-08 11:12:25
引用回帖:
4楼: Originally posted by ashleyoo00 at 2014-06-07 14:41:14
我用的就是这个方法，即在第一次PCR P第一段的时候就P不出来了。。然后基因的序列是知道的，以前用质粒做模板都挺好P的。。...

扩增片段大概多长呢？3KB以上的比较难P了。两端引物退火差距是不是过大，会不会形成引物间比较稳定的二聚体？
看你的电泳图，前面几道弥散得厉害，或者做一个巢式PCR可能能改善一些？
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5楼2014-06-07 14:46:37
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liug268 at 2014-06-07 14:46:37
扩增片段大概多长呢？3KB以上的比较难P了。两端引物退火差距是不是过大，会不会形成引物间比较稳定的二聚体？
看你的电泳图，前面几道弥散得厉害，或者做一个巢式PCR可能能改善一些？...

片段2000多bp，没有3000，引物退火温度相差在5°C内，只是不知道突变点对温度有没有影响。。
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6楼2014-06-08 11:05:50
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jmmchen

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ashleyoo00(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-08 16:33:40
说明你的引物设计的不是很合理，出现了引物二聚体。我建议你在突变位点设计的引物，使突变位点靠近引物的5'端，离3‘端远一些。因为引物的3’端是特异性结合的。而且引物的长度可以在30-40bp左右。你可以试一下。
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面朝大海，春暖花开
7楼2014-06-08 12:56:51
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jmmchen at 2014-06-08 12:56:51
说明你的引物设计的不是很合理，出现了引物二聚体。我建议你在突变位点设计的引物，使突变位点靠近引物的5'端，离3‘端远一些。因为引物的3’端是特异性结合的。而且引物的长度可以在30-40bp左右。你可以试一下。

那弥散的带是什么原因造成的？不会都是引物二聚体呀。
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8楼2014-06-08 14:31:48
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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)
这个跟引物的纯化方式有关系吗？？是不是OPC纯化不太好用做点突变PCR啊？~
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9楼2014-06-09 22:05:10
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伯牙119

新虫 (著名写手)
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10楼2019-08-07 23:22:21
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