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ashleyoo00

新虫 (初入文坛)

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[求助] 点突变PCR已有2人参与

最近在做点突变PCR，单个突变点，在第一步PCR就失败了。。按照引物Tm-5℃的退火温度（60℃）跑胶结果是弥散的带如图靠左2-7泳道。。模板是质粒，跑胶鉴定没降解；引物在突变点的5‘端有大于15bp，突变点的3’端大概8bp，不加模板P出来也只有引物二聚化的条带；然后PCR试过梯度退火温度，55-70℃，3℃一个梯度，其中55、58、61、64℃就有弥散的带，67、70℃没有条带（只有引物二聚化）；用的是fastpfu酶。。。

求解答><。。。

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1楼2014-06-06 21:47:15

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ashleyoo00

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引用回帖:

3楼: Originally posted by liug268 at 2014-06-07 10:32:56
我建议的方法是PCR桥接法，让第一段片段的下游引物（诱变引物）和第二段片段的上游引物（诱变引物）重合，然后进行整个片段的PCR，之后再酶切连接到质粒载体里面。
用质粒直接扩增难度比较大，而且在不知道序列的情 ...

我用的就是这个方法，即在第一次PCR P第一段的时候就P不出来了。。然后基因的序列是知道的，以前用质粒做模板都挺好P的。。