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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于pcr条带的问题,请虫高手们帮忙
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bijiaoyingyang

金虫 (小有名气)

[交流] 关于pcr条带的问题,请虫高手们帮忙

我的目的片段大小为900bp左右，
模板是含有目的基因的酵母细胞.用Taq酶扩增后目的1000--2000bp的非目的条带清晰，非特异性条带大小不一，但是很亮；
上游引物30bp,下游引物48bp.都带有酶切位点.
  请大家帮忙分析一下是什么原因，引物是否有问题？谢谢！
[search]pcr[/search]
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1楼 2008-03-19 17:49:22
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Sunnywhitebf

铜虫 (初入文坛)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 关注,.
提高一下退火温度再扩增一下试试，要不就是引物设计的特异性不够好，重新设计引物
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2楼2008-03-19 19:15:39
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 关注,.
二楼说的不错，如果有条件可以用touchdown PCR试试。
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细推物理须行乐。
3楼2008-03-19 22:12:43
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biocore

★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 关注,.
引用回帖:
Originally posted by bijiaoyingyang at 2008-3-19 17:49:
我的目的片段大小为900bp左右，
模板是含有目的基因的酵母细胞.用Taq酶扩增后目的1000--2000bp的非目的条带清晰，非特异性条带大小不一，但是很亮；
上游引物30bp,下游引物48bp.都带有酶切位点.
  请大家帮忙分 ...

呵呵，看看Taq酶有没有问题，以前我用过国产的Taq，菲特异性蛮强。
你30bp，和48bp的引物，和模板结合的序列是多少碱基？
如果结合的不多，菲特异性扩增也很多。
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4楼2008-03-19 22:19:22
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liumikewolf

金虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 关注,.
可能与镁离子浓度过高有关
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5楼2008-03-20 15:34:49
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bijiaoyingyang

金虫 (小有名气)

谢谢

谢谢指教！！我再试试看。
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6楼2008-03-21 01:46:20
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genehsy

金虫 (小有名气)
可以适当降低Tag酶和dNTP的用量，也可以尝试减少引物用量，祝您成功！
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7楼2008-03-21 09:13:26
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zhangda29

新虫 (初入文坛)
是不是可以换个酶试试！可能酶的特异性不好！
我用的是KOD-PLUS ,特异性很好！
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8楼2008-03-26 13:31:22
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引物有点长,一般18-25bp
退火温度尽量高点
非特异带有可能是目的基因的二连体,退火时间不能太长,否则易形成二连体
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9楼2008-03-26 18:11:25
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辛雨237

铁杆木虫 (著名写手)
引物序列为什么这么长阿
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春暖花开
10楼2008-03-26 20:09:34
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