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[交流] 利用基于半导体的第二代测序技术高通量的发掘兔基因组SNP

利用基于半导体的第二代测序技术高通量的发掘兔基因组SNP
意大利博洛尼亚大学F. Bertolini……L. Fontanesi*
虽然兔基因组测序和组装（oryCun2.0）已经完成，而且也有一些关于兔微卫星、SNP和CNV的研究，但是兔基因组大规模多态性发掘还没有报道。因此本研究利用离子流个人基因组测序仪（PGM）测序了HaeIII
and RsaI两个限制性酶的简化代表库（RRLs），识别了10只家兔（1只法国香槟兔，3只巨型格仔兔，1只勃艮第兔，2只维兰特兔和3只商业肉兔）基因组的SNPs。经过ION TORRENT suite v.2.2软件的过滤，两个库分别获得了2,917,879和4,046,871个reads，平均长度分别为96bp和103bp，总共长度分别为280.51Mb（248.49Mb的质量>20）和417.28Mb（360.89Mb的质量>20）。其中分别有2,627,434（90%）和3,685,226（91%）个reads比对到了兔基因组，占兔基因组的7.01%和9.06%（合并后为15.82%）。序列数据已经上传到欧洲核苷酸数据库（EMBL），序列号为ERP002438。实验要求至少有4个reads以上覆盖的SNP为高可信度SNP，因此只能在31,389,157bp和58,542,265bp兔基因组长度上寻找，其SNP的覆盖率分别是5.38和6.68。两个库的数据合并覆盖了兔基因组上107,922,811bp长度（<4reads的也算），深度为5.7X。本研究对SNP进行过滤，总共推断出62,491个SNPs，平均每1727bp一个SNP（62,491/107,922,811）。其中8号染色体和2号染色体SNP最多，分别为6,289和4,928个。SNP的密度最高的也是18号染色体，为11.1kb每SNP，最低在14号染色体，为50.8kb。研究又用桑格测序进行了验证，检测到了22个SNPs（OCU7上9个，OCU18上12个，OCU19上1个），其中16个SNPs在库中，包括一个reads小于4X的。也就是6/22的假阴性率和0/22的假阳性率。也就是说68%的高可信度SNPs（15个）检出率和100%假阳性率。大部分的SNPs都存在于基因间（67.3%）和内含子区域（32.5%）。位于编码区域的SNPs中有538个是同义突变，有479个是错义突变，有16个是无义突变。本研究结果为以后该物种的应用和基础研究提供了非常有用的信息。

交流与问题：
1，为什么选择reads的覆盖率为4X？从文中可以看到假阴性的原因主要就是SNP对reads的限制太严格。作为仅是对SNP的发掘，应该是可以有适当的假阳性，尽量减少假阴性。
2，桑格测序进行验证的时候，区域是如何选取的？可以这样理解吗，两个库中在这些区域上高可信度的SNPs为15个，且全部被桑格测序所发现，还有桑格测序发现的6个没有存在于库中？
3，三种突变合起来的SNP是1033个，占所有发现的1.65%。这与前面基因间和内含子区域的SNPs占99.8%有点不符合，是什么原因？
4，总得SNP密度为1727bp一个SNP，怎么密度最高的8号染色体密度反而是11.1kb一个SNP呢？是不是小数点打错了啊？
5，基因间区域和内含子区域怎么区别？基因间区域（ intergenic）就是不编码区域吧，不属于内含子区域？还是说内含子只是指基因内外显子之间的区域？

来源：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24444082-Bertolini F, Schiavo G, Scotti E, Ribani A, Martelli PL, Casadio R, Fontanesi L. High-throughput SNP discovery in the rabbit (Oryctolagus cuniculus) genome by next-generation semiconductor-based sequencing. Anim Genet, 2014, 45(2):304-7.

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