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如何把大肠杆菌中的质粒转化到农杆菌中
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最近做实验，刚刚接触这方面的东西，还不是很熟，问了周边的人，也没有做过，想把大肠杆菌中的质粒转化到农杆菌中，还请各位高手指教啊！ [ Last edited by lilyt on 2008-3-18 at 20:33 ] |
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annwt
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3楼2008-03-17 10:58:17
lauren180
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reasonspare(金币+3,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.
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农杆菌感受态细胞的制备 取-70℃保存的农杆菌于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。 转化农杆菌 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。28℃培养到形成单菌落。 |
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