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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » DNA提取
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一生的约定

金虫 (小有名气)

[求助] DNA提取 已有6人参与

1、 取500mL三角瓶装245mL生理盐水(0.85%NaCI)和少量玻璃珠(直径ca.3mm),高压蒸汽灭菌。
      2、称取茶叶样品5g倒入三角瓶中,室温下150rpm振荡30min,用双层灭菌纱布过滤,收集滤液,4℃下,10000Xg离心10min,收集沉淀,用1.0mL灭菌生理盐水悬浮沉淀,获得微生物菌体。
      3、将微生物菌体倒入灭菌研钵中,加入0.59灭菌石英砂,液氮研磨粉碎。
      4、用65℃预热的cTAB①提取液4mL洗涤匀浆液,转入10mL灭菌离心管中,并轻摇混匀,65℃水浴30min,冷却到室温后,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1,v/v),混匀,室温下,10000g离心10min,小心吸取上清转入新的10mL灭菌离心管中。向上清液加入等体积的预冷的异丙醇,轻轻混匀后放入一20℃冰箱至少30分钟以沉DNA  
      5、4℃下10000Xg离心10min,倒去上清液,用冰冷的70%乙醇溶液洗涤沉淀,4℃下10000Xg离心10min,重复2次。弃去上清后室温风干DNA。加70uLTE(20ug/mL RNase)溶解DNA,37℃温育30min以消除RNA,,取5uL DNA样品进行琼脂糖电泳检测提取结果。DNA溶液放入一20'C冰箱保存备用。

      请问这样提取DNA哪步有什么问题吗？为什么提了三四次都没有提出来呢？
      RNase浓度为10mg/ml, 我应该加多少RNase呢？
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广交益友，多多学习！
1楼 2014-05-19 22:36:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kexueyanjiu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-05-20 13:32:01
补充一下，RNase 我们一般加10ug/ml.
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4楼2014-05-20 09:28:04
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普通回帖

爱上鱼……

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-05-20 13:31:53
是不是微生物太少，提取的dna太少，检不出……
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懒病又犯了……
2楼2014-05-20 08:45:05
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kexueyanjiu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-05-20 13:31:57
沉淀至少30min后，离心时有白色透明沉淀吗？如若没有很可能跟你初始收集的菌体量较少有关。1：可以加大具体量 2：增加DNA沉淀时间。 3、 溶解DNA时少加一些TE或是ddH2O.
你检测时只用电泳检测的吗？要分光光度计也测一下，可是否真的没有，有时候电泳也会不准，肉眼看不到。 电泳检测时，你可以多上几微升的量。希望对你有所帮助。
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一生的约定
3楼2014-05-20 09:22:21
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一生的约定

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kexueyanjiu at 2014-05-20 09:28:04
补充一下，RNase 我们一般加10ug/ml.

RNase 的浓度为10mg/ml,请问加70uLTE(20ug/mL RNase)溶解DNA，需要加多少RNase 呢？
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广交益友，多多学习！
5楼2014-05-20 10:57:51
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一生的约定

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by kexueyanjiu at 2014-05-20 09:22:21
沉淀至少30min后，离心时有白色透明沉淀吗？如若没有很可能跟你初始收集的菌体量较少有关。1：可以加大具体量 2：增加DNA沉淀时间。 3、 溶解DNA时少加一些TE或是ddH2O.
你检测时只用电泳检测的吗？要分光光度计也 ...

离心的时候可以看到沉淀，不过不是白色的，我是用仪器测定DNA浓度的，浓度都很低，更关键的问题是260/230这个值太小了，请问是什么原因呢？会不会是RNase 的浓度太高了啊？
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广交益友，多多学习！
6楼2014-05-20 11:01:17
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一生的约定

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 爱上鱼…… at 2014-05-20 08:45:05
是不是微生物太少，提取的dna太少，检不出……

请问260/230的值太小了，是什么原因呢？
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广交益友，多多学习！
7楼2014-05-20 11:02:36
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lrnfighting

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.在提取微生物DNA之前要先养菌，测定生长曲线，再培养至对数期的前期，此时的菌数最多，能提取做多的DNA
2.使TE和核酸分离的方法：加2v无水乙醇、1/10v3M乙酸钠 pH5.2，再加0.6v异丙醇，在-20度冰箱放1-2h增加沉淀量
3,之后还要除盐，用75%乙醇洗涤即可，再离心，挑核酸，最后加RNase
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8楼2014-05-21 09:23:42
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litaoist

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
求微生物菌体获得的方法文献！我要从固态发酵基质中分离菌丝，如果这方法适用就太好了！

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-05-21 09:41:13
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knightdream

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一步，细胞能裂解么。核酸在盐水里的溶解度也要注意啊。这步骤问题太多了，还是买个盒子吧，国产的也没多少钱。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2014-05-21 09:45:26
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