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碧螺春晴

金虫 (正式写手)

[求助] 关于western显影是出的两个问题,求教!!!! 已有2人参与

各位高手有木有人做western时遇到这样的问题啊,就是在调β-actin的时候在目标条带下方出现了很黑的非特异性条带。最恶心的时荧光的时间非常的短,往往我在显第二个片的时候有些条带就变的很浅了,虽然荧光不会一直有但是也不会这么快就灭了吧,之前就很正常的。我想请教一下各位高手这是哪个环节出了问题啊。是发光剂出了问题么。人家是新虫没有太多的金币,大家帮帮忙嘛
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李小冬2

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1。ECL显影液失效,用二抗和ECL接触检查,
2.二抗孵育后洗膜用TTBS?、最后用TBS洗两遍,吐温对ECL显色有影响。
3.保鲜膜不干净(我觉得应该不是这个问题)
4.非特异性条带,第一是蛋白降解严重,在提取蛋白和制作上样液是注意加入蛋白酶抑制剂,第二是 一抗浓度太大,我平常1:5000、二抗:1:5000.第三是,蛋白上样液内蛋白浓度太大,β-actin含量多很少的蛋白样品就可以出来条带,而且条带之间更容易比较,我现在正在,试验没孔4ug上样液的结果。
2楼2014-05-16 21:14:15
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junboliang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
根据我的经验,荧光很快淬灭,大多是二抗的问题,建议更换二抗!
3楼2014-05-17 10:50:42
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碧螺春晴

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 李小冬2 at 2014-05-16 21:14:15
1。ECL显影液失效,用二抗和ECL接触检查,
2.二抗孵育后洗膜用TTBS?、最后用TBS洗两遍,吐温对ECL显色有影响。
3.保鲜膜不干净(我觉得应该不是这个问题)
4.非特异性条带,第一是蛋白降解严重,在提取蛋白和制作 ...

谢谢哦,进过多方比较应该是蛋白降解了哈
4楼2014-05-20 17:19:44
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