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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 关于western显影是出的两个问题，求教！！！！
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碧螺春晴

金虫 (正式写手)

[求助] 关于western显影是出的两个问题，求教！！！！ 已有2人参与

各位高手有木有人做western时遇到这样的问题啊，就是在调β-actin的时候在目标条带下方出现了很黑的非特异性条带。最恶心的时荧光的时间非常的短，往往我在显第二个片的时候有些条带就变的很浅了，虽然荧光不会一直有但是也不会这么快就灭了吧，之前就很正常的。我想请教一下各位高手这是哪个环节出了问题啊。是发光剂出了问题么。人家是新虫没有太多的金币，大家帮帮忙嘛
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1楼 2014-05-16 20:30:59
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李小冬2

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1。ECL显影液失效，用二抗和ECL接触检查，
2.二抗孵育后洗膜用TTBS?、最后用TBS洗两遍，吐温对ECL显色有影响。
3.保鲜膜不干净（我觉得应该不是这个问题）
4.非特异性条带，第一是蛋白降解严重，在提取蛋白和制作上样液是注意加入蛋白酶抑制剂，第二是 一抗浓度太大，我平常1：5000、二抗：1:5000.第三是，蛋白上样液内蛋白浓度太大，β-actin含量多很少的蛋白样品就可以出来条带，而且条带之间更容易比较，我现在正在，试验没孔4ug上样液的结果。
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2楼2014-05-16 21:14:15
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junboliang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据我的经验，荧光很快淬灭，大多是二抗的问题，建议更换二抗！
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3楼2014-05-17 10:50:42
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碧螺春晴

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 李小冬2 at 2014-05-16 21:14:15
1。ECL显影液失效，用二抗和ECL接触检查，
2.二抗孵育后洗膜用TTBS?、最后用TBS洗两遍，吐温对ECL显色有影响。
3.保鲜膜不干净（我觉得应该不是这个问题）
4.非特异性条带，第一是蛋白降解严重，在提取蛋白和制作 ...

谢谢哦，进过多方比较应该是蛋白降解了哈
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4楼2014-05-20 17:19:44
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