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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pet32a做载体，结果这一块做了三个月了还没连接成功
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-11 17:18:30
不同公司的酶平末端连接条件不一样，不过无外乎是延长连接时间...

嗯  好的  我试下
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21楼2014-05-11 21:57:06
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无敌小莫(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-14 09:08:21
先确定载体有没有切开，可以旁边点个完整质粒做对照，不在一条线上就算切开了
如果切的没有问题，改善连接体系，带越长越不容易连，你的目的条带达到了2700，应该是比较困难的，尽量延长连接时间，16度连20个小时以上再放在4度几个小时
连接体系中目的片段与载体的比例提升，降低连接体系体积，缩小到10微升甚至更小以增加分子之间碰撞的几率，比如目的片段：载体：buffer：酶=7:1:1:1试一试
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22楼2014-05-12 10:46:40
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
pcr产物可以回收一下。
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23楼2014-05-12 12:40:08
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 快乐农夫 at 2014-05-12 10:46:40
先确定载体有没有切开，可以旁边点个完整质粒做对照，不在一条线上就算切开了
如果切的没有问题，改善连接体系，带越长越不容易连，你的目的条带达到了2700，应该是比较困难的，尽量延长连接时间，16度连20个小时以 ...

我想加入聚乙二醇来增加连接效率
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24楼2014-05-13 08:59:19
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2014-05-12 12:40:08
pcr产物可以回收一下。

胶回收的效果不太好。可不可以用PCR产物纯化试剂盒纯化，酶切之后同样也用PCR产物纯化试剂盒纯化，再去连接啊？
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25楼2014-05-13 09:03:26
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-13 09:03:26
胶回收的效果不太好。可不可以用PCR产物纯化试剂盒纯化，酶切之后同样也用PCR产物纯化试剂盒纯化，再去连接啊？...

PCR完了肯定是要回收或者纯化后才酶切，酶切后肯定得回收或者纯化后才连接的。不说别的，肯定要把前一步实验的buffer都给去掉才能进行后续实验。。
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大家相互帮助哈
26楼2014-05-13 20:47:48
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红卫大兵

木虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-13 09:03:26
胶回收的效果不太好。可不可以用PCR产物纯化试剂盒纯化，酶切之后同样也用PCR产物纯化试剂盒纯化，再去连接啊？...

可以这么做
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27楼2014-05-13 22:59:45
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abc24687

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

个人认为经过切胶回收之后再去做连接，是你连接不成功的主要原因
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28楼2014-05-14 11:37:12
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jiangleiyu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以尝试用TaKaRa的QuickCut™ 限制性内切酶进行双酶切，里面自带通用的 10×QuickCut Buffer，双酶切效果还是比较好的；pET-32a长度约为5900bp，要想连接上一个2700bp的目的基因，连接效率肯定不会太高的，建议16度连接20h。
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29楼2014-05-14 20:04:34
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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

问题是这样：你手头上如果有pET32a连接了其他任何外源片段的质粒最好，在这个质粒上应保留BamHI和
XhoI切点，并且能切除小片段，这样你载体酶切的过程中，你可以确定载体是否完全切开，如果完全切开载体应该是5900bp左右  你可以用Fermantas的Marker对比；如果没有连接外源片段的pET32a，那么只能切空载体了，空载体判定是否酶切充分就很难了，因为它没有可见的小片段供观察，同时单酶切和双酶切的载体片段也分不开，一旦你的载体中有单酶切的片段，那么你长出的单菌落一定是载体自连。在确认载体酶切没有问题后，PCR产物酶切问题应该也就不大了，两个最好都过夜切。载体和外源连接比例是1:3~1:10 鉴于你的外源片段比较大，外源适当多加一些，总量在10ng~100ng之间即可（连接酶要用大厂家的）。如果不长菌，买感受态吧。
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30楼2014-05-15 10:10:23
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