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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
19楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-11 17:18:30
不同公司的酶平末端连接条件不一样,不过无外乎是延长连接时间...

嗯  好的  我试下
21楼2014-05-11 21:57:06
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
无敌小莫(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-14 09:08:21
先确定载体有没有切开,可以旁边点个完整质粒做对照,不在一条线上就算切开了
如果切的没有问题,改善连接体系,带越长越不容易连,你的目的条带达到了2700,应该是比较困难的,尽量延长连接时间,16度连20个小时以上再放在4度几个小时
连接体系中目的片段与载体的比例提升,降低连接体系体积,缩小到10微升甚至更小以增加分子之间碰撞的几率,比如目的片段:载体:buffer:酶=7:1:1:1试一试
22楼2014-05-12 10:46:40
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
pcr产物可以回收一下。
23楼2014-05-12 12:40:08
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
22楼: Originally posted by 快乐农夫 at 2014-05-12 10:46:40
先确定载体有没有切开,可以旁边点个完整质粒做对照,不在一条线上就算切开了
如果切的没有问题,改善连接体系,带越长越不容易连,你的目的条带达到了2700,应该是比较困难的,尽量延长连接时间,16度连20个小时以 ...

我想加入聚乙二醇来增加连接效率
24楼2014-05-13 08:59:19
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
23楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2014-05-12 12:40:08
pcr产物可以回收一下。

胶回收的效果不太好。可不可以用PCR产物纯化试剂盒纯化,酶切之后同样也用PCR产物纯化试剂盒纯化,再去连接啊?
25楼2014-05-13 09:03:26
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
25楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-13 09:03:26
胶回收的效果不太好。可不可以用PCR产物纯化试剂盒纯化,酶切之后同样也用PCR产物纯化试剂盒纯化,再去连接啊?...

PCR完了肯定是要回收或者纯化后才酶切,酶切后肯定得回收或者纯化后才连接的。不说别的,肯定要把前一步实验的buffer都给去掉才能进行后续实验。。
大家相互帮助哈
26楼2014-05-13 20:47:48
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

引用回帖:
25楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-13 09:03:26
胶回收的效果不太好。可不可以用PCR产物纯化试剂盒纯化,酶切之后同样也用PCR产物纯化试剂盒纯化,再去连接啊?...

可以这么做
27楼2014-05-13 22:59:45
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abc24687

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

个人认为经过切胶回收之后再去做连接,是你连接不成功的主要原因
28楼2014-05-14 11:37:12
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jiangleiyu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以尝试用TaKaRa的QuickCut™ 限制性内切酶进行双酶切,里面自带通用的 10×QuickCut Buffer,双酶切效果还是比较好的;pET-32a长度约为5900bp,要想连接上一个2700bp的目的基因,连接效率肯定不会太高的,建议16度连接20h。
29楼2014-05-14 20:04:34
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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

问题是这样:你手头上如果有pET32a连接了其他任何外源片段的质粒最好,在这个质粒上应保留BamHI和
XhoI切点,并且能切除小片段,这样你载体酶切的过程中,你可以确定载体是否完全切开,如果完全切开载体应该是5900bp左右  你可以用Fermantas的Marker对比;如果没有连接外源片段的pET32a,那么只能切空载体了,空载体判定是否酶切充分就很难了,因为它没有可见的小片段供观察,同时单酶切和双酶切的载体片段也分不开,一旦你的载体中有单酶切的片段,那么你长出的单菌落一定是载体自连。在确认载体酶切没有问题后,PCR产物酶切问题应该也就不大了,两个最好都过夜切。载体和外源连接比例是1:3~1:10 鉴于你的外源片段比较大,外源适当多加一些,总量在10ng~100ng之间即可(连接酶要用大厂家的)。如果不长菌,买感受态吧。
30楼2014-05-15 10:10:23
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