24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 3687  |  回复: 30

无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
19楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-11 17:18:30
不同公司的酶平末端连接条件不一样,不过无外乎是延长连接时间...

嗯  好的  我试下
21楼2014-05-11 21:57:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
无敌小莫(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-14 09:08:21
先确定载体有没有切开,可以旁边点个完整质粒做对照,不在一条线上就算切开了
如果切的没有问题,改善连接体系,带越长越不容易连,你的目的条带达到了2700,应该是比较困难的,尽量延长连接时间,16度连20个小时以上再放在4度几个小时
连接体系中目的片段与载体的比例提升,降低连接体系体积,缩小到10微升甚至更小以增加分子之间碰撞的几率,比如目的片段:载体:buffer:酶=7:1:1:1试一试
22楼2014-05-12 10:46:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
pcr产物可以回收一下。
23楼2014-05-12 12:40:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
22楼: Originally posted by 快乐农夫 at 2014-05-12 10:46:40
先确定载体有没有切开,可以旁边点个完整质粒做对照,不在一条线上就算切开了
如果切的没有问题,改善连接体系,带越长越不容易连,你的目的条带达到了2700,应该是比较困难的,尽量延长连接时间,16度连20个小时以 ...

我想加入聚乙二醇来增加连接效率
24楼2014-05-13 08:59:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
23楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2014-05-12 12:40:08
pcr产物可以回收一下。

胶回收的效果不太好。可不可以用PCR产物纯化试剂盒纯化,酶切之后同样也用PCR产物纯化试剂盒纯化,再去连接啊?
25楼2014-05-13 09:03:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
25楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-13 09:03:26
胶回收的效果不太好。可不可以用PCR产物纯化试剂盒纯化,酶切之后同样也用PCR产物纯化试剂盒纯化,再去连接啊?...

PCR完了肯定是要回收或者纯化后才酶切,酶切后肯定得回收或者纯化后才连接的。不说别的,肯定要把前一步实验的buffer都给去掉才能进行后续实验。。
大家相互帮助哈
26楼2014-05-13 20:47:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

红卫大兵

木虫 (正式写手)

引用回帖:
25楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-13 09:03:26
胶回收的效果不太好。可不可以用PCR产物纯化试剂盒纯化,酶切之后同样也用PCR产物纯化试剂盒纯化,再去连接啊?...

可以这么做
27楼2014-05-13 22:59:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

abc24687

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

个人认为经过切胶回收之后再去做连接,是你连接不成功的主要原因
28楼2014-05-14 11:37:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiangleiyu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以尝试用TaKaRa的QuickCut™ 限制性内切酶进行双酶切,里面自带通用的 10×QuickCut Buffer,双酶切效果还是比较好的;pET-32a长度约为5900bp,要想连接上一个2700bp的目的基因,连接效率肯定不会太高的,建议16度连接20h。
29楼2014-05-14 20:04:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

问题是这样:你手头上如果有pET32a连接了其他任何外源片段的质粒最好,在这个质粒上应保留BamHI和
XhoI切点,并且能切除小片段,这样你载体酶切的过程中,你可以确定载体是否完全切开,如果完全切开载体应该是5900bp左右  你可以用Fermantas的Marker对比;如果没有连接外源片段的pET32a,那么只能切空载体了,空载体判定是否酶切充分就很难了,因为它没有可见的小片段供观察,同时单酶切和双酶切的载体片段也分不开,一旦你的载体中有单酶切的片段,那么你长出的单菌落一定是载体自连。在确认载体酶切没有问题后,PCR产物酶切问题应该也就不大了,两个最好都过夜切。载体和外源连接比例是1:3~1:10 鉴于你的外源片段比较大,外源适当多加一些,总量在10ng~100ng之间即可(连接酶要用大厂家的)。如果不长菌,买感受态吧。
30楼2014-05-15 10:10:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 无敌小莫 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿郑州大学材料与化工085600,求调剂 +17 吃的不少 2026-04-02 17/850 2026-04-03 21:48 by qlm5820
[考研] 求调剂 +3 wos666 2026-04-03 3/150 2026-04-03 21:36 by lbsjt
[考研] 一志愿重庆大学085404,总分314分,求调剂 +4 zf83hn 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:25 by 啵啵啵0119
[考研] 278求调剂 +4 Yy7400 2026-04-03 4/200 2026-04-03 20:40 by zhq0425
[考研] 考研调剂 +8 不爱喝饮料 2026-04-03 8/400 2026-04-03 16:40 by Mistake-J
[考研] 求调剂 +3 usbdndj 2026-04-03 3/150 2026-04-03 14:10 by dxiaoxin
[考研] 08工科275分求调剂 +14 AaAa7420 2026-03-31 14/700 2026-04-03 11:13 by cocolv
[考研] 312求调剂 +6 小小墨123 2026-04-02 7/350 2026-04-03 07:32 by jsw79
[考研] 一志愿南开大学0710生物学359求调剂 +6 兔兔兔111223314 2026-03-29 8/400 2026-04-02 22:37 by louise0220
[考研] 求调剂 302分初试 0854 +5 伶可乐 2026-04-02 5/250 2026-04-02 17:53 by 笔落锦州
[考研] 318求调剂,计算材料方向 +10 吸喵有害笙命 2026-04-01 11/550 2026-04-02 16:29 by oooqiao
[考研] 0710生物学求调剂 +9 manman511 2026-04-01 9/450 2026-04-02 10:00 by zxl830724
[考研] 348环境工程调剂 +3 吴彦祖24k 2026-04-01 3/150 2026-04-02 09:14 by nanaliuyun
[考研] 350求调剂 +7 阿佳~ 2026-03-31 7/350 2026-04-01 16:12 by yanflower7133
[考研] 283求调剂 +9 A child 2026-03-28 9/450 2026-04-01 14:20 by Jaylen.
[考研] 一志愿武理材料工程302调剂环化或化工 +15 Doleres 2026-03-31 16/800 2026-04-01 09:49 by lfj11
[基金申请] 面上5B能上会吗? +8 redcom 2026-03-29 8/400 2026-03-31 15:53 by niuailing
[考研] 求收留 +8 1943443204 2026-03-28 8/400 2026-03-31 15:00 by -迷了路啊路
[考研] 本科211安全工程,初试290分,求调剂 +3 2719846834 2026-03-28 3/150 2026-03-31 13:52 by 热情沙漠
[考研] 279求调剂 +4 蝶舞轻绕 2026-03-29 4/200 2026-03-29 09:45 by laoshidan
信息提示
请填处理意见