6楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-11 00:59:30
可能出现的问题有以下3个方面：
1.酶切的问题，生工的内切酶没用过，如果走双酶切建议你先把那两个内切酶的说明书看一下，选用兼容的buffer对双酶切影响很大，而且要确定这两个酶是否会受到dam、GC甲基化的影响，其 ...

8楼: Originally posted by yxlijian at 2014-05-11 07:44:44
建议更改连接方法，in-fusion clone 或 seamless clone方法，效率高些！转化方法可以用化学转化，如果可以电转更好！不明白之处可以随时交流！

12楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 10:11:41
看起来略微有点吃力。我在想把目的基因酶切过夜好了，之前做成功都是酶切过夜的。但老师说是有星活性的问题。。。还有，T4DNA连接酶多加一点可否？照理说我的目的基因和载体质粒在琼脂糖凝胶电泳上的条带亮度都还可 ...

13楼: Originally posted by yxlijian at 2014-05-11 10:32:32
因为你的插入片段比较长，传统的连接方法效率低，因此，提高你的连接和转化效率是关键。与其在传统的连接方法中困惑，不如选择我推荐你的方法一试。这两种方法的连接效率非常高。...

10楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 10:02:46
我之前有做成功过一个重组菌，现在这个问题是根本做不出来了。是不是目的基因太大，没有酶切完全呐...

9楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 10:01:43
酶切效率不清楚啊，都是酶切完直接做连接的，不过琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的条带是那种灰暗的亮带...

12楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 10:11:41
看起来略微有点吃力。我在想把目的基因酶切过夜好了，之前做成功都是酶切过夜的。但老师说是有星活性的问题。。。还有，T4DNA连接酶多加一点可否？照理说我的目的基因和载体质粒在琼脂糖凝胶电泳上的条带亮度都还可 ...

16楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-11 13:10:07
生工的内切酶我没用过，好不好用不好说，真不行就就按我说的先连T载体再切，还有XHOI的切出来的基因都建议用平末端的连接条件连接，你的T4酶是Takara的话，建议16度酶连16个小时。...

18楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 14:55:26
平末端连接条件就是16℃连接16h吗？...