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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pet32a做载体，结果这一块做了三个月了还没连接成功
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-11 00:59:30
可能出现的问题有以下3个方面：
1.酶切的问题，生工的内切酶没用过，如果走双酶切建议你先把那两个内切酶的说明书看一下，选用兼容的buffer对双酶切影响很大，而且要确定这两个酶是否会受到dam、GC甲基化的影响，其 ...

PCR是用的高保真酶
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11楼2014-05-11 10:06:15
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yxlijian at 2014-05-11 07:44:44
建议更改连接方法，in-fusion clone 或 seamless clone方法，效率高些！转化方法可以用化学转化，如果可以电转更好！不明白之处可以随时交流！

看起来略微有点吃力。我在想把目的基因酶切过夜好了，之前做成功都是酶切过夜的。但老师说是有星活性的问题。。。还有，T4DNA连接酶多加一点可否？照理说我的目的基因和载体质粒在琼脂糖凝胶电泳上的条带亮度都还可以，怎么会连一个连接成功的菌落都没有呢。。三个月了啊。。。
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12楼2014-05-11 10:11:41
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yxlijian

木虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 10:11:41
看起来略微有点吃力。我在想把目的基因酶切过夜好了，之前做成功都是酶切过夜的。但老师说是有星活性的问题。。。还有，T4DNA连接酶多加一点可否？照理说我的目的基因和载体质粒在琼脂糖凝胶电泳上的条带亮度都还可 ...

因为你的插入片段比较长，传统的连接方法效率低，因此，提高你的连接和转化效率是关键。与其在传统的连接方法中困惑，不如选择我推荐你的方法一试。这两种方法的连接效率非常高。
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13楼2014-05-11 10:32:32
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by yxlijian at 2014-05-11 10:32:32
因为你的插入片段比较长，传统的连接方法效率低，因此，提高你的连接和转化效率是关键。与其在传统的连接方法中困惑，不如选择我推荐你的方法一试。这两种方法的连接效率非常高。...

条件有限，不可能重新买试剂的。。
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14楼2014-05-11 11:34:44
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 10:02:46
我之前有做成功过一个重组菌，现在这个问题是根本做不出来了。是不是目的基因太大，没有酶切完全呐...

酶切酶连就是看概率的，XHOI的粘性末端连接效率与同类比起来本来就不高，需要长时间酶连。
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大家相互帮助哈
15楼2014-05-11 13:00:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 10:01:43
酶切效率不清楚啊，都是酶切完直接做连接的，不过琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的条带是那种灰暗的亮带...

生工的内切酶我没用过，好不好用不好说，真不行就就按我说的先连T载体再切，还有XHOI的切出来的基因都建议用平末端的连接条件连接，你的T4酶是Takara的话，建议16度酶连16个小时。
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大家相互帮助哈
16楼2014-05-11 13:10:07
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 10:11:41
看起来略微有点吃力。我在想把目的基因酶切过夜好了，之前做成功都是酶切过夜的。但老师说是有星活性的问题。。。还有，T4DNA连接酶多加一点可否？照理说我的目的基因和载体质粒在琼脂糖凝胶电泳上的条带亮度都还可 ...

如果想酶切过夜建议不要用37度，25度甚至16度对保存酶活和抑制star活性都有效果。
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大家相互帮助哈
17楼2014-05-11 13:15:09
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-11 13:10:07
生工的内切酶我没用过，好不好用不好说，真不行就就按我说的先连T载体再切，还有XHOI的切出来的基因都建议用平末端的连接条件连接，你的T4酶是Takara的话，建议16度酶连16个小时。...

平末端连接条件就是16℃连接16h吗？
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18楼2014-05-11 14:55:26
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-05-11 14:55:26
平末端连接条件就是16℃连接16h吗？...

不同公司的酶平末端连接条件不一样，不过无外乎是延长连接时间
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大家相互帮助哈
19楼2014-05-11 17:18:30
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2008116068

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分别单酶切，回收，在连接
载体与目的基因浓度比为1:10---3:10之间为宜
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只要踮起脚尖，就离太阳更近一点！！！
20楼2014-05-11 18:19:11
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