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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

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[求助] pet32a做载体，结果这一块做了三个月了还没连接成功已有11人参与

pet32做表达载体的克隆。卡在这里三个月了，一直没做成。载体是pet32a双酶切（BamHI,Xhol）6h，目的基因大概是2700bp，也是双酶切6h，用的是T4DNA连接酶，一直没有连接成功，哪怕是酶切胶回收后的产物在琼脂糖凝胶电泳上比较亮的情况下仍是没有连接成功，不知道您能不能给点建议，小子我目前还是本科生，苦在这里好久了，希望得到您的帮助，谢谢！

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1楼2014-05-10 19:13:42

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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无敌小莫(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2014-05-11 08:55:25

可能出现的问题有以下3个方面：
1.酶切的问题，生工的内切酶没用过，如果走双酶切建议你先把那两个内切酶的说明书看一下，选用兼容的buffer对双酶切影响很大，而且要确定这两个酶是否会受到dam、GC甲基化的影响，其次你的载体双酶切切胶回收的是线性化的载体，至于是单切和双切是无法区分的，如果你的基因是直接PCR回收后做的双切也是一样的问题。如果其他问题都排除了，我建议基因就用加了酶切位点的引物和末端能加A的保真酶PCR后连T载体，之后双酶切重组T载体，只要切出来两条带回收2700的基因一定是双切的产物。而载体在转化的时候做一个阴性对照就能检测出载体是否完全双切。
2.酶连的问题，先假设你的基因和载体是完全双切了，但是基因和载体的比例不对会导致连接效率很差一样不行，这个你得先把你用的公司的T4酶说明书找出来，上面肯定有该酶推荐的配比，有些公司是质量比，有些公司是摩尔比，摩尔比要比质量比靠谱，一般基因和载体的摩尔比在3:1或者更高一些比较适合，一般实验室大家做都喜欢用体积比，这个比例最不靠谱，因为不同的人做，或者不同的操作这个值都不一样，建议用nano drop测一下你回收后的浓度，至少算出来个质量比，光靠电泳检测的亮度有时候是不靠谱的。pET32a大概5900bp，你2700的基因应该还好，不算太大。
3.转化的问题，首先是感受态，你的感受态如果不是商品购买的话，自然有转化效率的问题，如果没有做阳性对照的话，我建议你做一下就知道你的感受态能不能用了。直接用质粒转化，如果感受态可以的话，0.5ul质粒就应该是满板的转化子，如果少于50个那说明你的感受态不行，那就得优化感受态的制备了，如果阳性对照过关了还是没转化出来，而且以上可能出现的问题解决过了，我建议你做阴性对照，就是拿你双酶切的载体不加基因直接转化，如果载体没有充分双酶切的话，其余载体很容易自连，这样阴性对照的平板上也会有很多的转化子，那就说明问题还在酶切上，建议分步酶切，或者换其他公司的内切酶试试。