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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pet32a做载体，结果这一块做了三个月了还没连接成功
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

[求助] pet32a做载体，结果这一块做了三个月了还没连接成功 已有11人参与

pet32做表达载体的克隆。卡在这里三个月了，一直没做成。载体是pet32a双酶切（BamHI,Xhol）6h，目的基因大概是2700bp，也是双酶切6h，用的是T4DNA连接酶，一直没有连接成功，哪怕是酶切胶回收后的产物在琼脂糖凝胶电泳上比较亮的情况下仍是没有连接成功，不知道您能不能给点建议，小子我目前还是本科生，苦在这里好久了，希望得到您的帮助，谢谢！
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1楼 2014-05-10 19:13:42
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-10 23:57:01
酶切效率怎么样？连接转化效率怎么样？
...

酶切效率不清楚啊，都是酶切完直接做连接的，不过琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的条带是那种灰暗的亮带
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9楼2014-05-11 10:01:43
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-05-11 08:55:11
你用的哪家的酶切的，从哪里切，转化后什么情况？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-05-10 19:40:44
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-10 19:40:44
你用的哪家的酶切的，从哪里切，转化后什么情况？

上海生工的。转化了好多次，一般都是不长菌，偶尔长出一些菌，但是用单酶切，菌落pcr，或者是SDS电泳都没有检测到目的条带，每次都是没有想要的结果，真的是心碎了。。。导师是让一直重复的做下去。。。
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3楼2014-05-10 22:40:05
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-11 08:55:17
很久没做原核表达了，需要提出一个问题，就是PET载体，尤其32a，能插入的最大/最长片段是多少bp？？
感觉2700bp是不是有点太长了！？
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4楼2014-05-10 23:34:54
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