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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

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[求助] pet32a做载体，结果这一块做了三个月了还没连接成功已有11人参与

pet32做表达载体的克隆。卡在这里三个月了，一直没做成。载体是pet32a双酶切（BamHI,Xhol）6h，目的基因大概是2700bp，也是双酶切6h，用的是T4DNA连接酶，一直没有连接成功，哪怕是酶切胶回收后的产物在琼脂糖凝胶电泳上比较亮的情况下仍是没有连接成功，不知道您能不能给点建议，小子我目前还是本科生，苦在这里好久了，希望得到您的帮助，谢谢！

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1楼2014-05-10 19:13:42

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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

问题是这样：你手头上如果有pET32a连接了其他任何外源片段的质粒最好，在这个质粒上应保留BamHI和
XhoI切点，并且能切除小片段，这样你载体酶切的过程中，你可以确定载体是否完全切开，如果完全切开载体应该是5900bp左右你可以用Fermantas的Marker对比；如果没有连接外源片段的pET32a，那么只能切空载体了，空载体判定是否酶切充分就很难了，因为它没有可见的小片段供观察，同时单酶切和双酶切的载体片段也分不开，一旦你的载体中有单酶切的片段，那么你长出的单菌落一定是载体自连。在确认载体酶切没有问题后，PCR产物酶切问题应该也就不大了，两个最好都过夜切。载体和外源连接比例是1:3~1:10 鉴于你的外源片段比较大，外源适当多加一些，总量在10ng~100ng之间即可（连接酶要用大厂家的）。如果不长菌，买感受态吧。