应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pet32a做载体，结果这一块做了三个月了还没连接成功
53/1返回列表
查看: 4387  |  回复: 30
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

无敌小莫

铜虫 (小有名气)

[求助] pet32a做载体，结果这一块做了三个月了还没连接成功 已有11人参与

pet32做表达载体的克隆。卡在这里三个月了，一直没做成。载体是pet32a双酶切（BamHI,Xhol）6h，目的基因大概是2700bp，也是双酶切6h，用的是T4DNA连接酶，一直没有连接成功，哪怕是酶切胶回收后的产物在琼脂糖凝胶电泳上比较亮的情况下仍是没有连接成功，不知道您能不能给点建议，小子我目前还是本科生，苦在这里好久了，希望得到您的帮助，谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2014-05-10 19:13:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无敌小莫(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-14 09:08:21
先确定载体有没有切开，可以旁边点个完整质粒做对照，不在一条线上就算切开了
如果切的没有问题，改善连接体系，带越长越不容易连，你的目的条带达到了2700，应该是比较困难的，尽量延长连接时间，16度连20个小时以上再放在4度几个小时
连接体系中目的片段与载体的比例提升，降低连接体系体积，缩小到10微升甚至更小以增加分子之间碰撞的几率，比如目的片段：载体：buffer：酶=7:1:1:1试一试
赞一下(1人) 回复此楼
22楼2014-05-12 10:46:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 31 个回答

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-05-11 08:55:11
你用的哪家的酶切的，从哪里切，转化后什么情况？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2014-05-10 19:40:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-10 19:40:44
你用的哪家的酶切的，从哪里切，转化后什么情况？

上海生工的。转化了好多次，一般都是不长菌，偶尔长出一些菌，但是用单酶切，菌落pcr，或者是SDS电泳都没有检测到目的条带，每次都是没有想要的结果，真的是心碎了。。。导师是让一直重复的做下去。。。
赞一下 回复此楼
3楼2014-05-10 22:40:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-11 08:55:17
很久没做原核表达了，需要提出一个问题，就是PET载体，尤其32a，能插入的最大/最长片段是多少bp？？
感觉2700bp是不是有点太长了！？
赞一下 回复此楼
4楼2014-05-10 23:34:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 31 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭