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[交流] 单抗药物的糖基化工程之去海藻糖化已有1人参与

（转自 www.bettermab.com 单抗技术和药物动态）
单抗在恒定区(CH2)的Asn297有一个糖基化位点，该位点的糖基化在核心的G0形式之外，会添加不同的侧链糖基，其中包括海藻糖(fucose)。而研究证实，单抗在添加海藻糖之后，将降低其与FcγRIIIa (CD16)的亲和力，因而抑制了单抗药物的ADCC活性。因而去海藻糖化是单抗糖基化工程的一个很重要的方向。下文简述了当前比较成功的去海藻糖的几个专利技术。
1. POTELLIGENT
该技术由日本的Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.,公司开发，其东京研究实验室与2004年公开发表了其该技术的细节（BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 87, NO. 5, SEPTEMBER 5, 2004）。该公司在2008年与Kirin Pharma Co., Ltd.合并，改名为Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd。现该技术由其美国子公司BioWa专门负责在全球的授权业务。
Potelligent技术的关键点是利用同源重组的方法将CHO/DG44宿主细胞的两个 FUT8等位基因都敲除，而该基因是负责将海藻糖（fucose）添加到抗体糖基化位点的糖链中（下图）。因而当FUT8基因完全敲除后，该宿主细胞在生产抗体时，将不在糖链中加入海藻糖。无/低海藻糖的单抗与FcγRIIIa (CD16)的亲和力更高，因而能够促进抗体药物的ADCC活性。
BioWa当前已经将该技术授权给绝大部分跨国制药公司，包括BMS，Merk, Novartis, Pfizer, Medimmune, Genentech,GSK等。而且Lonza利用其技术开发了新的CHO细胞株Potelligent® CHOK1SV，配合其专利的GS筛选系统，用于抗体高表达细胞株的开发。
此外，Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.公司还开发了利用RNAi技术敲低CHO细胞中FUT8表达的技术平台（BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 88, NO. 7, DECEMBER 30, 2004），但该技术不能完全阻止在单抗的糖链中添加海藻糖，只能将无海藻糖的单抗比例由亲本CHO细胞的10%提高至60%左右。
在2007年，Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.公司又公开报道了其利用siRNA的方法双敲出Fut8和GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD)的新技术。在两个月内，可以完成细胞株的改造，而且可以实现单抗制备时的无海藻糖化。
基于RNAi技术的优点是可以方便的对已构建的单抗药物高表达细胞株进行改造。而Potelligent技术因同源重组的高难度而只适合用改造后的Protelligent CHO细胞株开发目的抗体的高表达细胞株。

2.GlymaxX
德国公司proBioGen在2010年报道了其专利技术GlymaxX（Glycobiology vol. 20 no. 12 pp. 1607–1618, 2010）。该专利技术的目的与上述Potelligent相同，就是能够制备无/低海藻糖的单抗，以提高单抗药物的ADCC活性。但与Potelligent技术中敲出内源性FUT8基因不同,该GlymaxX技术的核心是在CHO细胞中引入一个细菌的异源酶GDP-6-deoxy-D-lyxo -4-hexulose reductase（RMD）。该酶可以将CHO细胞内源合成海藻糖（fucose）的中间产物GDP-4-keto-6-deoxymannose转化为CHO细胞不可利用的GDP-D-Rhamnose，从而阻断了内源性的fucose的合成，进而制备无/低海藻糖的单抗药物。
该技术的最大优点是可以很方便对已有的单抗药物细胞株进行改造，改造周期短至10周，比用同源重组的方法更方便快捷。在2014年3月，ProBioGen宣布将该技术非排他地授权给 Merus B.V.公司。

3.GlycoMab
此技术平台最早由瑞士的GlycArt公司开发，并在1999年申请了专利（US6602684 B1）。该技术的核心是在CHO细胞中过表达β(1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III (GnT III) ，该酶将在抗体的核心糖链中添加更多的bisecting N-acetylglucosamine (GlcNAc)，即合成G0b, G1,b, G2b等。而这类抗体介导的ADCC功能更高。事实上，后来的研究证实，糖链中含更多GlcNAc的单抗具有更高ADCC活性的根本原因是在糖链中添加GlcNAc之后，抑制了在糖链中添加fucos，进而提高了抗体与FcγRIIIa (CD16)的亲和力，因而能够促进抗体药物的ADCC活性。基于此技术，GlycArt公司开发了新的一代抗CD20单抗（Obinutuzumab）。Roche公司在2005年收购了GlycArt，并获得了Obinutuzumab，该单抗药物在2013年成功上市，商品名为Gazyva。Gazyva是第一个在美国上市的糖基化工程改造的单抗药物。
（转自 www.bettermab.com 单抗技术和药物动态）

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