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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 提取质粒
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闲庭晓苑

新虫 (初入文坛)

[交流] 提取质粒

pcr产物连接T载体，涂平板，培养过夜，挑取单菌落，做PCR 电泳检测，可以跑出目标条带，然后再扩大培养，提取质粒后再检测，竟然没有条带了，谁能帮我分析一下问题出在哪了呢！
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1楼 2014-05-08 15:36:17
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青一

铁杆木虫 (职业作家)
★
闲庭晓苑(金币+1): 谢谢参与
祝福，帮顶
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2楼2014-05-08 15:57:30
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瓶儿水青

新虫 (初入文坛)
你确定你连接的片段大肠杆菌中没有相似序列吗？怀疑本次实验失败，你下次挑菌验证时最好以大肠杆菌基因组做模板做个负对照，排除假阳性

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13楼2014-05-09 00:31:44
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瓶儿水青

新虫 (初入文坛)
也有可能是质粒没提好，试剂或操作可能有不合适的地方，在抗性条件下能长的起来？

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14楼2014-05-09 00:34:28
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闲庭晓苑

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 瓶儿水青 at 2014-05-09 00:34:28
也有可能是质粒没提好，试剂或操作可能有不合适的地方，在抗性条件下能长的起来？

是在抗性条件下长出来的，两个样品同时提质粒，一个有条带一个没有
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15楼2014-05-09 07:56:53
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闲庭晓苑

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 瓶儿水青 at 2014-05-09 00:31:44
你确定你连接的片段大肠杆菌中没有相似序列吗？怀疑本次实验失败，你下次挑菌验证时最好以大肠杆菌基因组做模板做个负对照，排除假阳性

不确定有没有相似的序列，我这次链接载体就是用来测序的 ！
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16楼2014-05-09 07:58:16
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瓶儿水青

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 闲庭晓苑 at 2014-05-09 07:58:16
不确定有没有相似的序列，我这次链接载体就是用来测序的 ！...

也就是说转化子现在抽提不出质粒但有抗是吧，排除抽提质粒操作问题，我怀疑是染的抗性杂菌，有可能大肠或杂菌本身有与你研究的序列相似的序列，你pcr验证时能扩出相应大小的条带，但并不是来源你构建的质粒，也就是说你的转化子是假阳性，所以抽不出质粒

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17楼2014-05-09 13:10:21
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瓶儿水青

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 闲庭晓苑 at 2014-05-09 07:58:16
不确定有没有相似的序列，我这次链接载体就是用来测序的 ！...

验证时对照很重要

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18楼2014-05-09 13:11:53
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snowbridge3楼
2014-05-08 15:58   回复  
闲庭晓苑(金币+1): 谢谢参与
6465105804楼
2014-05-08 16:17   回复  
闲庭晓苑(金币+1): 谢谢参与
liyangsoton5楼
2014-05-08 16:18   回复  
闲庭晓苑(金币+1): 谢谢参与
假大空6楼
2014-05-08 16:21   回复  
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nono20097楼
2014-05-08 16:29   回复  
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xiejf8楼
2014-05-08 16:39   回复  
闲庭晓苑(金币+1): 谢谢参与
1
tzynew9楼
2014-05-08 16:50   回复  
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bigdale10楼
2014-05-08 17:33   回复  
闲庭晓苑(金币+1): 谢谢参与
好
wuer41302311楼
2014-05-08 20:24   回复  
闲庭晓苑(金币+1): 谢谢参与
zls611012楼
2014-05-08 20:25   回复  
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