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416158716金虫 (小有名气)
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[求助]
求大神指点qPCR结果，相对定量，动物给药后各个个体表达相差数量级，求助~~~~ 已有1人参与
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本人新手做动物的RT-PCR检测试验，实验设计是动物分组造模后，对动物进行给药，再检测动物目标基因的表达情况。 选择的内参基因是GAPDH，使用的动物组织是肝脏，固定检测老鼠的某一分页。 内参的delta Rn vs cycle 的线非常集中，这个是不是代表我的内参已经没有问题？  内参的扩增曲线  目标基因的delta Rn vs cycle线比较层级分布  目标基因的扩增曲线  但是经过系统计算后的2-ΔΔCT法结果显示  从结果可知，动物个体的目标基因表达十分大，达到1-2个数量级的差别，也就是说最高比最低可能达100多倍，这种结果可信吗？ 对于我的实验结果，我也仔细去分析过问题，首先是内参，这是我沿用别人的选择GAPDH，我也查到很多文献是拿这个内参进行大鼠肝脏PCR实验的，而且我的delta图显示，内参在各个样本上的扩增上相对整齐，Ct大概在15左右，是不是可以得出结果内参没有问题？ 其次，分析目标基因序列问题，目标的基因序列是我从NCBI的gene中，通过查找大鼠相关基因的引物方法找到的，去年利用同样的序列进行过大鼠脑部位的PCR，结果相对整齐，不会出现这么悬殊的情况。最近也拿该引物序列在NCBI上重新BLAST了，可以查找到所扩增的目标蛋白，表面这个基因应该引物序列没有错误？？？。从扩增的图可以看出，有的个体Ct在21-23，有的个体Ct在28-31，出现这种情况的原因我不太懂。是不是究其目标基因在个体表达就是存在差异？。但是按这个Ct值算得的结果是数量级差别。这个Ct的范围在多大范围内才可信？ 我之前一直怀疑是不是组织内的RNA降级了，所以后来又重复了一批次的动物，所有的条件都控制得很好，包括组织从动物上取材后，生理盐水清洗，滤纸吸干，立刻放入冰盒中保存，半小时内存入-20度冰箱，整个实验取材流程在4小时内，所有取材完毕后立即放入-80度冰箱保存，提取rna等操作按标准流程。从结果看，最先取材的空白组，模型组，目标基因的表达都相对较高，其他给药组反而相对较低，能否说明我组织RNA是稳定的？是药物影响RNA表达？ 另外从扩增的溶解曲线图发现，产物的Tm值相对接近，溶解曲线没有产生任何小峰，所以认为特异性比较良好，我这个想法正确吗？  之前也曾经怀疑过是不是试剂盒牌子的问题，试过Takara、thermo的qPCR kit，同样的结果。 心里有很多疑问： 1. 如果RNA降解了，是不是不但目标基因，连内参基因也会受影响？有没有大神能告诉我，从我的数据图看，我的样品是否存在问题？ 2. 这个Ct值在什么范围才可靠？我的样品的目标基因相对来说，主要集中23-24,28-30,两个范围，而内参主要集中在15左右，这能否说明只是样品本身的表达造成的？而非引物设计，或者其他问题？ 3. 出现这种相差这么大的个体差异，是否就是动物本身就是这样？求有做过动物基因检测的大神指点指点？ 4. 相对定量PCR发文章时采用的统计方法2-ΔΔCT法，但是我用这个的结果相差很大，能否使用其他统计方法？ 5. 本实验室使用的是ABI 7500系统及软件，其中产生的结果是按照2-ΔΔCT法给出的结果，相差很大，其中graph setting的Y-axis 使用的RAW RQ。看过很多相对定量PCR的数据处理结果图给出的是Y-axis使用的log10 RQ，基因如果下调会产生负值，但是看一些文章给出的相对表达的图都是正值，那么我究竟使用什么图示比较合理？ 求大神指点迷津，不胜感激。。有些地方可能表述不是很好，求指导！！ |
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朱珠41600
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2楼2014-04-25 21:08:44
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416158716: 金币+20, ★有帮助, 很好的交流，谢谢！ 2014-05-02 00:04:10
416158716: 金币+20, ★有帮助, 很好的交流，谢谢！ 2014-05-02 00:04:10
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我最近也在做q-PCR,咱们可以相互学习一下，我也是半懂半疑，希望能帮到你。 1、内参应该没有问题，指数增长期较集中，Ct值在20左右很好的，你的阈值是自动还是自己设置？Ct值在20左右最好，不要超过30就好（经验），你的内参与目的基因Ct有点大，你的cDNA稀释了多少倍？最好先做一个标准曲线，再决定浓度，我的用的稀释10倍做的。 2、相对定量，差距不在数量级上吧，哪有100倍，希望你看一下计算公式及，只是与内参的一个相对值，本人觉得是2倍。 3、溶解曲线单峰说明扩增较单一 我做的是植物，也比较浅显，希望帮到你。 |
3楼2014-05-01 16:03:19
416158716
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4楼2014-05-02 00:10:11
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