| 查看: 775 | 回复: 3 | ||||
[求助]
RT-PCR
|
|
各位，做RT-PCR前反转录的一步中，RNA和与Oligo(dT)及dNTP mixture 65度保温5分钟后迅速在冰上急冷有什么作用呢？ 做荧光定量PCR就不需要65度保温，这有什么区别呢？ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生物学技术 |
» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有63人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
Neo2000
木虫 (著名写手)
- 应助: 639 (博士)
- 金币: 8720.2
- 红花: 37
- 帖子: 1700
- 在线: 269.3小时
- 虫号: 322365
- 注册: 2007-03-11
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
2楼2014-04-25 17:20:05
biostar2009
专家顾问 (正式写手)
-
专家经验: +220 - MolEPI: 20
- 应助: 231 (大学生)
- 金币: 10375.9
- 散金: 387
- 红花: 63
- 帖子: 540
- 在线: 151.9小时
- 虫号: 2811882
- 注册: 2013-11-19
- 专业: 生物化学
- 管辖: 分子生物
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
伊梦青lhq(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-04-25 18:49:52
伊梦青lhq: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-04-26 12:50:53
感谢参与，应助指数 +1
伊梦青lhq(西门吹雪170代发): 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2014-04-25 18:49:52
伊梦青lhq: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-04-26 12:50:53
|
关于RT之前，RNA跟RT-primer变性之后怎么处理，现在的商品化酶的做法跟之前的传统做法有些不同。 不管是DNA还是RNA，高温处理叫变性，这个没问题 高温之后放冰上，就是你所谓的“急冷”，是在干嘛？ 高温处理之后的核酸，所有配对已经打开，如果这个时候缓慢降温，就是annealing过程，退火，目的是有助于能够配对部分的序列发生配对。变性+退火是个不破不立的过程，原本的核酸，可能因为种种原因，该配对的没有配上，或者想加入一个东西参与配对——比如引物。首先通过高温破坏原有结构，再缓慢降温，实现新的配对。 “急冷”，可以想象，那就是个全程破坏的过程。通过高温把原有的配对打开，然后迅速降温，使得核酸没有机会再去形成合理的配对——注意，何谓合理的配对，就是更长，更准确而没有错配的配对。即便是急速降温，核酸也不可能保持在单链状态，而是形成一种不合理的配对状态——混乱的，更短的，更多错配的配对状态。 急冷，现在最常用于变性核酸电泳。这里的情况又有点不同，这里的急冷是为了保护胜利果实。在变性电泳loading buffer里，通过变性剂如尿素，甲酰胺制造的环境中，核酸是不容易配对的，高温通过将已有的配对打开，而急冷是为了防止仍旧可能的复性的发生，因为即便是不容易配对的环境，核酸作为一个高分子，以数量取胜的稳定性还是不容小觑的。 现在的很多商品化酶的说明书，已经不再强调RT之前的变性要冰浴了，很多只是要求从70oC将至室温即可，虽然这会让RNA形成更多的“美好”配对，但是这也有助于引物的配对，如何权衡是一个效率问题。要注意，RT过程中的模板的二级结构的问题，是RT酶要去面对的，这一点人能帮忙的力量不大。 |
3楼2014-04-25 17:46:46
4楼2014-04-26 12:35:28