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RT-PCR
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各位，做RT-PCR前反转录的一步中，RNA和与Oligo(dT)及dNTP mixture 65度保温5分钟后迅速在冰上急冷有什么作用呢？ 做荧光定量PCR就不需要65度保温，这有什么区别呢？ |
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 分子生物学技术 |
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关于RT之前，RNA跟RT-primer变性之后怎么处理，现在的商品化酶的做法跟之前的传统做法有些不同。 不管是DNA还是RNA，高温处理叫变性，这个没问题 高温之后放冰上，就是你所谓的“急冷”，是在干嘛？ 高温处理之后的核酸，所有配对已经打开，如果这个时候缓慢降温，就是annealing过程，退火，目的是有助于能够配对部分的序列发生配对。变性+退火是个不破不立的过程，原本的核酸，可能因为种种原因，该配对的没有配上，或者想加入一个东西参与配对——比如引物。首先通过高温破坏原有结构，再缓慢降温，实现新的配对。 “急冷”，可以想象，那就是个全程破坏的过程。通过高温把原有的配对打开，然后迅速降温，使得核酸没有机会再去形成合理的配对——注意，何谓合理的配对，就是更长，更准确而没有错配的配对。即便是急速降温，核酸也不可能保持在单链状态，而是形成一种不合理的配对状态——混乱的，更短的，更多错配的配对状态。 急冷，现在最常用于变性核酸电泳。这里的情况又有点不同，这里的急冷是为了保护胜利果实。在变性电泳loading buffer里，通过变性剂如尿素，甲酰胺制造的环境中，核酸是不容易配对的，高温通过将已有的配对打开，而急冷是为了防止仍旧可能的复性的发生，因为即便是不容易配对的环境，核酸作为一个高分子，以数量取胜的稳定性还是不容小觑的。 现在的很多商品化酶的说明书，已经不再强调RT之前的变性要冰浴了，很多只是要求从70oC将至室温即可，虽然这会让RNA形成更多的“美好”配对，但是这也有助于引物的配对，如何权衡是一个效率问题。要注意，RT过程中的模板的二级结构的问题，是RT酶要去面对的，这一点人能帮忙的力量不大。 |
3楼2014-04-25 17:46:46
4楼2014-04-26 12:35:28
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