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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 姜的总RNA提取，电泳只有一条带
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议用天恩泽的试剂盒提一下！手提估计很难！
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11楼2014-04-21 09:02:49
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2014-04-19 19:44:50
这个protocol是典型的提取DNA的操作步骤

提RNA得用trizol试剂...

不对啊  我是根据文献的操作来的啊。参考文献是：A simple and rapid method for RNA isolation from plant tissues with high phenolic compounds and polysaccharides.
Extraction buffer: 0.25 M NaCl, 0.05 M Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM EDTA, 1% (w/v) sodium dodecyl sulphate (SDS) and 4% (w/v) PVP (M.W. 360,000)

RNA extraction  
1 Add 7.5 ml of extraction buffer and 7.5 ml of CI to a 30 ml-round bottom Nalgene tube.  
2 Grind 1 g frozen mangosteen sample to fine powder with a mortar and pestle in liquid nitrogen.
3 Transfer 1 g of ground sample to a tube containing the extraction buffer and CI and vortex vigorously.  
4 Centrifuge at 12,857 g for 2 min at room temperature.
5 Transfer the supernatant to a new 30 ml-round bottom Nalgene tube and purify with an equal volume of PCI. Centrifuge at 12,857 g for 2 min at room temperature. Repeat this step until there
is a clean interface observed.
6 Transfer the supernatant to a new 30 ml-round bottom Nalgene tube and add one tenth volume of 3 M sodium acetate pH 5.2 and 2.5 volume of cold absolute ethanol, mix well, and incubate at 4 °C for 30 min.
7 Recover the nucleic acids by centrifugation at 12,857 g for 20 min at 4 °C.
8 Wash the pellet with 70% (v/v) ethanol, air-dry, and add 200 μl DEPC-treated water to dissolve the pellet.
9 Transfer the supernatant to a 1.5 ml tube and add 10 M LiCl to a final concentration of 2 M and keep on ice for 1 h. Centrifuge at 18,514 g for 20 min at 4 °C.
10 Wash the pellet with 70% (v/v) ethanol, air-dry, and add 20 μl DEPC-treated water to
dissolve the pellet. Centrifuge at 18,514 g for 10 min at 4 °C.
11 Add 0.1 volume of 3 M sodium acetate pH 5.2 and 2.5 volume of cold absolute ethanol, mix well, and store at -80 °C.
Analysis of RNA quality  
12. The total RNA was quantified with a spectrophotometer at 230, 260, 280 nm. The integrity of total RNA was verified by analyzing approximately 1 μg RNA sample on 1% (w/v) formaldehyde denaturing agarose gel
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12楼2014-04-21 09:03:36
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by allegory at 2014-04-19 21:01:17
用invitrogen的trizol，之后加氯仿，你试试看。

我用过trizol提取，没提取出来。不过不是invitrogen的trizol，是天根的。因为姜的组织里面含有很多多糖、淀粉之类的东西。会与RNA形成复合物沉淀下来，所以有人说trizol提不出来。我就上网查的这个方法。
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13楼2014-04-21 09:05:44
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by grape_vine at 2014-04-21 09:02:49
建议用天恩泽的试剂盒提一下！手提估计很难！

我用过天根的植物总RNA提取试剂盒来提取，没提取出来。
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14楼2014-04-21 09:07:07
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by iamcsy at 2014-04-19 15:55:56
就图片来看，太难看了！28s和18s都烂成这样，还想看5s呢！还有，DNA都没除尽。

想问一下，你提取过植物的RNA吗？我所提取的是姜的RNA，刚种下去发芽就提了，这个提取阶段是不是不适合啊？还是怎么回事？
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15楼2014-04-21 09:08:41
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-04-19 21:22:09
上边的条带是DNA，不是28S，28S和18S条带都在2000bp以下

我查过细菌的好想大概是这样的大小范围，植物的也是这样吗？ 用普通的胶跑的有影响吗？网上有报道说 植物的在4kb左右。
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16楼2014-04-21 09:10:31
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by fanwq258 at 2014-04-20 11:40:33
这是SDS法提DNA，不是提RNA。

我是按文献操作来做的呀。
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17楼2014-04-21 09:10:47
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Allen206

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-04-19 21:22:09
上边的条带是DNA，不是28S，28S和18S条带都在2000bp以下

如果不从大小上分辨，能看出来哪个是DNA哪个是RNA 么？
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不想说什么，，，，
18楼2014-04-21 09:42:31
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fuchange918

木虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 夏菡小屋 at 2014-04-21 09:10:31
我查过细菌的好想大概是这样的大小范围，植物的也是这样吗？ 用普通的胶跑的有影响吗？网上有报道说 植物的在4kb左右。...

我的真菌RNA三条带都在2000bp以下
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19楼2014-04-21 10:41:44
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fanwq258

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-21 12:03:09
引用回帖:
17楼: Originally posted by 夏菡小屋 at 2014-04-21 09:10:47
我是按文献操作来做的呀。...

这种SDS法主要是用于提取核酸的，主要是DNA，当然，RNA也能够提取出来，但是质量不太好，你还得去除基因组DNA。建议你还是用trizol法提RNA吧。
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
20楼2014-04-21 10:43:55
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