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夏菡小屋金虫 (正式写手)
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姜的总RNA提取，电泳只有一条带已有5人参与
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见图，这是我今天提取姜的总RNA结果图，旁边是TAKARA的DL5000 marker，用的是1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳，总共提取了7管，用了三个不同的方法，其中一个方法（Lane 3）未见条带，其余均有明显条带，感觉有降解，但只有一个明显的条带，这是28s RNA吗？姜的28s 和18s，5s RNA到底是多大啊，求指导！！这种图显示，应该问题出在什么地方？ 无标题1.png |
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夏菡小屋
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不对啊 我是根据文献的操作来的啊。参考文献是：A simple and rapid method for RNA isolation from plant tissues with high phenolic compounds and polysaccharides. Extraction buffer: 0.25 M NaCl, 0.05 M Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM EDTA, 1% (w/v) sodium dodecyl sulphate (SDS) and 4% (w/v) PVP (M.W. 360,000) RNA extraction 1 Add 7.5 ml of extraction buffer and 7.5 ml of CI to a 30 ml-round bottom Nalgene tube. 2 Grind 1 g frozen mangosteen sample to fine powder with a mortar and pestle in liquid nitrogen. 3 Transfer 1 g of ground sample to a tube containing the extraction buffer and CI and vortex vigorously. 4 Centrifuge at 12,857 g for 2 min at room temperature. 5 Transfer the supernatant to a new 30 ml-round bottom Nalgene tube and purify with an equal volume of PCI. Centrifuge at 12,857 g for 2 min at room temperature. Repeat this step until there is a clean interface observed. 6 Transfer the supernatant to a new 30 ml-round bottom Nalgene tube and add one tenth volume of 3 M sodium acetate pH 5.2 and 2.5 volume of cold absolute ethanol, mix well, and incubate at 4 °C for 30 min. 7 Recover the nucleic acids by centrifugation at 12,857 g for 20 min at 4 °C. 8 Wash the pellet with 70% (v/v) ethanol, air-dry, and add 200 μl DEPC-treated water to dissolve the pellet. 9 Transfer the supernatant to a 1.5 ml tube and add 10 M LiCl to a final concentration of 2 M and keep on ice for 1 h. Centrifuge at 18,514 g for 20 min at 4 °C. 10 Wash the pellet with 70% (v/v) ethanol, air-dry, and add 20 μl DEPC-treated water to dissolve the pellet. Centrifuge at 18,514 g for 10 min at 4 °C. 11 Add 0.1 volume of 3 M sodium acetate pH 5.2 and 2.5 volume of cold absolute ethanol, mix well, and store at -80 °C. Analysis of RNA quality 12. The total RNA was quantified with a spectrophotometer at 230, 260, 280 nm. The integrity of total RNA was verified by analyzing approximately 1 μg RNA sample on 1% (w/v) formaldehyde denaturing agarose gel |
12楼2014-04-21 09:03:36
2楼2014-04-19 15:55:56
gyesang
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3楼2014-04-19 17:27:13
夏菡小屋
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抽提缓冲液：0.25M NaCl，0.05M Tris-HCl（pH7.5），20mM EDTA，1%（w/v）SDS，4%(w/v) PVP(M.W.360,000) 提取步骤： 1.1.5ml离心管中加入0.5ml抽提缓冲液和0.5ml 苯酚氯仿异戊醇（25:24:1）； 2.0.5g冰冻样品至研钵中，在液氮存在下研磨成粉末； 3.转移1g样品至离心管中（步骤1），涡旋剧烈震荡混匀； 4.4℃离心12000rpm*10min； 5.转移上清至另一离心管中，加入等体积的 苯酚氯仿异戊醇（25:24:1），4℃离心12000rpm*3min，重复此步骤直到能看到一个清晰的界面； 6.转移上清至新的离心管中，加入十分之一体积3M醋酸钠(pH5.2)以及2.5倍体积冷无水乙醇，混匀后，4℃孵育30min； 7.再次4℃离心12000rpm*20min； 8.冷的70%乙醇洗涤后干燥，加入200μL DEPC处理水溶解沉淀； 9.转移上清至新的离心管中加入4M LiCl至终浓度为2M，冰上放置1h，4℃离心12000rpm*20min； 10. 冷的70%乙醇洗涤后干燥，加入50μL DEPC处理水溶解沉淀； 请问我的步骤有问题吗? |
4楼2014-04-19 17:48:16