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flyhigher

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】细菌基因敲除

没有做过分子的实验,老板一下子就让做基因敲除,现在一点门路都没有,同学都没人做,大家帮帮忙吧,现在敲除细菌染色体上的一段基因(500bp大概)最常用的方法或最容易实现的方法是什么啊,具体步骤都是什么啊,快帮帮我吧,要不然真的又得换题了,现在都博二了,马上就要中期了,郁闷死我了!!
[search]基因敲除[/search]

[ Last edited by flyhigher on 2008-3-19 at 11:06 ]
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booksworm

铜虫 (小有名气)

★ ★ ★
flyhigher(金币+3,VIP+0):真是感谢啊!!
主要原理是同源重组的原则,利用同源序列的交换将你的目的基因敲除。具体:(1)找一个温敏性质粒;(2)用PCR的方法扩增你目的基因两侧各200bp左右的片段,要加上适当的酶切位点;(3)选择一个合适的抗性标记,(4)将抗性标记连接与两个片段的中间,然后与温敏质粒连接(5)转化大肠杆菌(6)通过合适的抗性筛选就可以了得到你的工程菌株了。
6楼2008-03-18 10:38:52
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)


flyhigher(金币+1,VIP+0):多谢大侠,要是能详细些就好了啊
克隆基因上下游,中间连结选择标记,转化细菌,根据选择标记挑选转化子,进一步PCR southern杂交等验证转化子
2楼2008-03-06 08:07:47
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wujiequn

捐助贵宾 (小有名气)


flyhigher(金币+1,VIP+0):大侠能详细一点解释么?因为我是初入分生,很多都不懂,麻烦了!
接合转移,同源双交换
3楼2008-03-06 10:18:36
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flyhigher

银虫 (小有名气)

哪位老大能详细一点指导以下我啊,多谢多谢了!
4楼2008-03-10 13:18:27
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