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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】细菌基因敲除
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flyhigher

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】细菌基因敲除

没有做过分子的实验，老板一下子就让做基因敲除，现在一点门路都没有，同学都没人做，大家帮帮忙吧，现在敲除细菌染色体上的一段基因（500bp大概）最常用的方法或最容易实现的方法是什么啊，具体步骤都是什么啊，快帮帮我吧，要不然真的又得换题了，现在都博二了，马上就要中期了，郁闷死我了！！
[search]基因敲除[/search]

[ Last edited by flyhigher on 2008-3-19 at 11:06 ]
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1楼 2008-03-05 18:28:19
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★
flyhigher(金币+1,VIP+0):多谢大侠，要是能详细些就好了啊
克隆基因上下游,中间连结选择标记,转化细菌,根据选择标记挑选转化子,进一步PCR southern杂交等验证转化子
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2楼2008-03-06 08:07:47
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wujiequn

捐助贵宾 (小有名气)
★
flyhigher(金币+1,VIP+0):大侠能详细一点解释么？因为我是初入分生，很多都不懂，麻烦了！
接合转移，同源双交换
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3楼2008-03-06 10:18:36
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flyhigher

银虫 (小有名气)
哪位老大能详细一点指导以下我啊，多谢多谢了！
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4楼2008-03-10 13:18:27
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elton_monkey

银虫 (初入文坛)
★ ★
flyhigher(金币+2,VIP+0):多谢多谢！
找一篇博士论文看看了，常见的就是单交换双交换了，接合转移方法都差不多，但是不同的细菌要选择不同的质粒，这个就比较麻烦了，如果你的菌没人做过，你就得把常用的质粒都筛一遍找到合适的。有些细菌如果没有合适的载体就只能噬菌体转染了，这个得看具体情况。
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5楼2008-03-17 13:52:30
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booksworm

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
flyhigher(金币+3,VIP+0):真是感谢啊！！
主要原理是同源重组的原则，利用同源序列的交换将你的目的基因敲除。具体：（1）找一个温敏性质粒；（2）用PCR的方法扩增你目的基因两侧各200bp左右的片段，要加上适当的酶切位点；（3）选择一个合适的抗性标记，（4）将抗性标记连接与两个片段的中间，然后与温敏质粒连接（5）转化大肠杆菌（6）通过合适的抗性筛选就可以了得到你的工程菌株了。
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6楼2008-03-18 10:38:52
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