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jiangpozi

新虫 (小有名气)

[求助] 大片段克隆真心求教!!! 已有3人参与

我克隆一个8000bp左右的基因,就有一次惊鸿一现出来过,用的是takara GXL高保真酶,现在一直在做都没有条带了。现在换了takara LA Taq酶,不知道应该怎么加?之前。引物设计有没有大虾能帮下小弟呢?万分感谢 分都会给你的。CDS:      126 atgtc tggcactgcc acagttctgc agcagtttgt gagtggcctg aagagtcgca
      181 atgaagacac tcgtgccaaa gctgccaaag accttcagca ctacgtcacg acagaactaa
      241 gagagctgag ccaagatgaa gccaccactt tctacgatga actgaaccac cacatttttg
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      361 tgattggagt ggagggagga aatgccaccc gtatcagccg ctttgccaac tatttgcgga
      421 acctgcttcc gtccagtgac tcagtggtca tggagatggc ctctaaagcc atgggtcacc
      481 tgtccatggc gggagacacc ttcactgcag agtatgtgga gtttgaggtg aagagagctc
      541 tggagtggct gggagcagac aggaatgaag gcagacgaca tgcagcggtg ctggtgttac
      601 gagaactggc tgtcagcgca cctacattct ttttccagca ggtgcagcca ttctttgata
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     1081 tgctgggtta cagcacacct cagggcttct taagttttgg agctgcacct gttccctcga
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     1201 tgtgccgttg ggtgctgaaa tacaggacca gtaagaatcc tctaatccag atgacaatct
     1261 taaacctact gcctcgactt gctgccttcc agcctcacac tttcactgat cagtatttgc
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     1381 ttcaagcgct ggggctactg gtggtggctg tgagggctga tattcagcca tacctaagca
     1441 agatcctgga gattatcaaa gctgcattgc caccgaaaga ctttgcgcac aagaggcaga
     1501 agaccatgca ggtggatgct actgtattta cttgcataag tatgctgtcc agagctatgg
     1561 ggcctagcat ccaacaggac gtcaaagaac ttctggagcc catgctagct gttggtctca
     1621 gccctgcttt gactgcagtg ctttacgacc tgagcaggca gatcccacag ctgaagaagg
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     1741 acccgggtat gcccaagggc ctggcgtatc agctgtcatc gcccagcctg accaacatcc
     1801 ctgaggctag cgacgtgggc agcataactc tggcactgag aactctcggc agctttgaat
     1861 ttgaaggcca ctccttgacc cagtttgtgc gtcactgtgc ggaccacttt ttgaacagcg
     1921 agcacaagga gatccgcatg gaggcggcgc gcacctgctc acgtctgctt accccctcca
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     2041 acgttctcag caagctactt gtggttggca tcactgaccc agaccctgat attcgatact
     2101 gtgtgctggc ctccctggac gaacgctttg atgcccacct ggcacaagca gagaacctcc
     2161 aggctctgtt tgtggcgctg aatgatgaag tgtttgagat ccgcgaactg gccatctgca
     2221 ccatcggtcg actcagcagt atgaaccctg cctttgtcat gcccttctgg cccaagatgc
     2281 tcattcagat tctgactgag ctggaacata gcggtgtggg ccgaaacaaa gagcagagtg
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     2401 ccattctcaa ggccctcatt ttaaagctga aagatcccga tccaaaccct ggagttgtca
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
jiangpozi(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-19 13:33:24
如果没有同源性高的基因干扰,直接从头到尾扩就好,多测几个平行的杨

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-04-19 12:50:37
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KEVIN_LOVE

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
jiangpozi(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-19 13:33:00
用多次重叠延伸试试,也就是得在引物上多下些功夫。如果只用一对引物将大片段克隆出来确实很困难。
2楼2014-04-19 10:05:25
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黩武

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该是引物问题吧
最好把你的引物列出来
虽然没有用过takara的酶 但是用TOYOBO KOD做过10kb+的质粒PCR 没有问题的
P不出来 多加Mg 再加5% DMSO

但是从cDNA中克隆的话就爱莫能助了
4楼2014-04-20 15:04:45
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jiangpozi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 黩武 at 2014-04-20 15:04:45
应该是引物问题吧
最好把你的引物列出来
虽然没有用过takara的酶 但是用TOYOBO KOD做过10kb+的质粒PCR 没有问题的
P不出来 多加Mg 再加5% DMSO

但是从cDNA中克隆的话就爱莫能助了

我是看到一篇文献上的这个引物,做出来过一次,再重复就没有了。怎么办呢
大片段克隆真心求教!!!
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5楼2014-04-21 21:54:40
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