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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 已经快PCR折磨疯了。。救命呀
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whitewave

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
26楼: Originally posted by wanglixia815 at 2014-04-11 17:20:44
胶什么叫银然。。。我的胶就是加了一个叫gel red的东西。。1ul
他们跑的DNA模板还可以啊。。。
我用的是TBE 我的引物应该没有问题  因为我之前用同样的引物在别的城市做过十个样 是成功的。。。我昨天用的2%的胶 ...

我印象你的目标产物大概八百，我记得最佳应该百分之一左右的胶，百分之二的胶应该跑一百两百的短片段！当然最好你看分子克隆都写了！引物你还是要注意，如果你不是保存的干粉或者100的储存液在-20,20浓度的经常用放4度一个月没有问题，但是你反复-20,4度冻溶我的经验是不好，如果一周都做还是直接放4度，好几天不做再放-20！再多说句胶，水你可以多放5～10ml根本就没有事，如果你怕煮久了干。最后提醒下，有些试剂只能用TAE跑，TBE不能沉降产物。缓冲液要换，长期不换也不行，如果实验室有两种缓冲液的小心配胶和跑胶的不配套！我很是不明白，不是特别难扩增的产物为什那么多人都还说的传统的酶镁离子分开的，新手为什么不用预混的，只加水模板加预混试剂，不出错效果也好，难道我没有遇到真正高难扩的产物？还是买试剂都是七零前的老古董？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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天生我才
31楼2014-04-12 00:40:05
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userhung

禁虫 (文学泰斗)

木虫博士

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模糊是工艺问题，随便送哪个都可以，后者更纯~~~~~~~~~~~~~~
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32楼2014-04-12 06:22:50
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wanglixia815

新虫 (正式写手)
引用回帖:
31楼: Originally posted by whitewave at 2014-04-12 00:40:05
我印象你的目标产物大概八百，我记得最佳应该百分之一左右的胶，百分之二的胶应该跑一百两百的短片段！当然最好你看分子克隆都写了！引物你还是要注意，如果你不是保存的干粉或者100的储存液在-20,20浓度的经常用放 ...

我用的是预混液，我的引物在零下20的，有位老师建议我用1，但是这位要用2，很无语
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有点矛盾。有点纠结
33楼2014-04-14 03:57:11
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wanglixia815

新虫 (正式写手)
引用回帖:
32楼: Originally posted by userhung at 2014-04-12 06:22:50
模糊是工艺问题，随便送哪个都可以，后者更纯~~~~~~~~~~~~~~

不懂，什么意思模糊只是工艺问题。ccc
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有点矛盾。有点纠结
34楼2014-04-14 03:58:18
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lsg-ll

银虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by wanglixia815 at 2014-04-11 17:22:26
我后来问了一个和我做的差不多一个老师 她说她直接送的PCR产物，让公司去纯化。。我觉得也是  太费劲了...

如果目的带很特异 可以公司纯，直接过个柱子就可以去除2聚体，，有杂带还是自己切比较好。
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人生就像一直虫子，爬呀爬呀
35楼2014-04-15 15:07:11
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wanglixia815

新虫 (正式写手)
引用回帖:
35楼: Originally posted by lsg-ll at 2014-04-15 15:07:11
如果目的带很特异 可以公司纯，直接过个柱子就可以去除2聚体，，有杂带还是自己切比较好。...

谢谢拉，问一个弱小的问题，我怎么才能知道我自己目的性片段，我是
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有点矛盾。有点纠结
36楼2014-04-20 18:23:42
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ljhzyy

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你要搞明白 你要去测序 需要得到的是你的目标条带 也就是说 最好是一个纯的DNA 你PCR完的话 因为每次的条件都不一样，你的PCR管里理论上 存在着很多 目的基因 非特异性扩增的条带 各种杂质 引物什么的 这些都是必须要除去的 否则 你的测序结果很容易出错误 切胶回收就是找到你的目标基因 ，因而你的基因理论上应该是比较纯的 有利于测序 关于你的胶  建议你更换缓冲液 我猜测 条带跑歪有可能和里面的电流方向不稳定 你可以看看在跑胶的过程中 水流是否流动 实验台是否有移动
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37楼2014-04-20 19:25:59
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lsg-ll

银虫 (小有名气)
引用回帖:
36楼: Originally posted by wanglixia815 at 2014-04-20 18:23:42
谢谢拉，问一个弱小的问题，我怎么才能知道我自己目的性片段，我是...

初步确定 根据片段大小啊  ，等测完序才完全确定
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人生就像一直虫子，爬呀爬呀
38楼2014-04-21 11:30:16
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wanglixia815

新虫 (正式写手)
引用回帖:
38楼: Originally posted by lsg-ll at 2014-04-21 11:30:16
初步确定 根据片段大小啊  ，等测完序才完全确定...

ITS1 + 5.8 + ITS2?这是目的基因的名称吗？
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有点矛盾。有点纠结
39楼2014-04-21 16:06:16
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lsg-ll

银虫 (小有名气)
引用回帖:
39楼: Originally posted by wanglixia815 at 2014-04-21 16:06:16
ITS1 + 5.8 + ITS2?这是目的基因的名称吗？...

这个 都不能叫做基因吧，目的片段，看别人文献的一半都多大， 然后切了测序就行了，然后再做你的后续分析
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人生就像一直虫子，爬呀爬呀
40楼2014-04-21 16:26:36
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