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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR扩增图片求助
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0209cy

铜虫 (小有名气)

[交流] PCR扩增图片求助

提取的是昆虫总RNA，提取的质量可能不是很好吧，反转录成cDNA后做为模板，
PCR程序为：94℃ 3min，一个循环
                   94℃ 30s  50℃ 45s  72℃ 1min 35个循环
                  72℃   10min  一个循环

电泳结果怎么老是出现弥散的带啊？？？大小在800bp左右，到底是什么原因，请各位大虾指教啊 ！！谢谢哦
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1楼 2008-02-28 17:59:22
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
可能反应体系的试剂不好
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2楼2008-03-02 11:11:44
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annwt

木虫 (正式写手)
引物的退火温度是多少，怎么计算的？
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3楼2008-03-02 11:13:53
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lovebaby

铜虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie,
是不是引物的特异性不好?跑变性胶试试,可能是会分离出很多带
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4楼2008-03-02 11:43:04
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0209cy

铜虫 (小有名气)

回复

引用回帖:
Originally posted by annwt at 2008-3-2 11:13:
引物的退火温度是多少，怎么计算的？

引物的退火温度是50度，但引物合成单两条引物都是60多度的退火温度，50度是我自己试试看设定的。
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5楼2008-03-02 12:14:30
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0209cy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lovebaby at 2008-3-2 11:43:
是不是引物的特异性不好?跑变性胶试试,可能是会分离出很多带

我设计的是兼并引物，特意性会不好吗？什么是变性胶啊？我是初学什么都不懂啊！！！
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6楼2008-03-02 12:15:55
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0209cy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jurkat.1640 at 2008-3-2 11:11:
可能反应体系的试剂不好

我同学也是用的这些试剂，他的没有问题啊
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7楼2008-03-02 12:16:51
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie, . 期待更多精彩
提高一下退火温度试试50℃有点低，一般选择范围是Tm正负5℃，最好比Tm低3℃。当然只是经验，具体引物还是具体分析。
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细推物理须行乐。
8楼2008-03-02 12:22:31
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dreamsail

银虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie 欢迎常来,.兄弟很热心.
撇开PCR的问题不说的话,也许有可能有电泳的问题,一般电压不超过5V/cm,但是也不要太小,不然会扩散得厉害.

多试几次吧~记得去年我自己试一两个月,天天跑.
好运!
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9楼2008-03-03 01:10:47
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十比

木虫 (著名写手)
可能引物的问题吧,增加引物浓度看.
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10楼2008-03-03 17:12:05
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