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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请问WB做成这样，说明人品已经极差了吗？
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wybiology

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 请问WB做成这样，说明人品已经极差了吗？ 已有1人参与

各位大虫，中午好！
我做WB，上了5个泳道，实验结果如图，是内参蛋白H3（histone H3，14kDa）和目的蛋白(是两个条带，42kDa和38kDa),蓝色为marker（第一个图是内参的，第二个图是目的蛋白的）。我跑胶了以后没有考染，直接做WB，做出来这样的结果。解释不了为什么会是这样的结果？marker是好的，说明不是胶的问题。蛋白上样量150微克（上样量不能再少了，再少的话我的目的条带就不清晰了）。而我的目的蛋白WB以后出来还算勉强，但有点模糊和拖尾。所以我觉得极可能是蛋白的问题。
因为我不想上样体积太大，总体积约为20微升，所以我打算是10微的蛋白溶液和10微的2×SDS loading buffer，但是最后蛋白上样量保证150微克的条件下，蛋白上样体积就会超过10微甚至达到16微，然后剩余的体积我就把加2×SDS buffer补足20微，这会导致上样前煮沸的过程中蛋白没有溶解好或没有完全溶解吗，会造成这样的结果吗？
提取的植物总蛋白，然后用很剧烈的方式振荡溶解的，这样会对蛋白有什么影响吗？
感谢有经验的大虫，解答问题，如果还有可能其他的原因导致这样的结果，请提供您的宝贵建议或意见，谢谢！

请问WB做成这样，说明人品已经极差了吗？
内参蛋白H3.jpg


请问WB做成这样，说明人品已经极差了吗？-1
目的蛋白.jpg
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1楼 2014-04-03 11:19:04
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wybiology

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-03 12:27:28
内参出现弯曲的现象应该是由于你跑胶的时候跑到太底了吧，底部的胶布均匀，而且你的内参的抗体可以少加点，曝光的时候曝光时间减短。因为内参只有14K，建议配13%-15%的胶，不要跑到太底。

跑胶没有跑到太底，这个我比较确定。因为之前做过几次WB都没有出现过这样的情况，这次唯一不同的就是2×SDS lb的使用量不足。所以我在担心以后是否还会出现同样的状况。内参抗体的稀释倍数确实需要在提高一些。谢谢您的建议。是否还可能有其他的影响因素呢？
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3楼2014-04-03 14:38:56
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wybiology(youlinglyw代发): 金币+2 2014-04-03 14:58:51
内参出现弯曲的现象应该是由于你跑胶的时候跑到太底了吧，底部的胶布均匀，而且你的内参的抗体可以少加点，曝光的时候曝光时间减短。因为内参只有14K，建议配13%-15%的胶，不要跑到太底。
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2楼2014-04-03 12:27:28
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wybiology

捐助贵宾 (小有名气)
WB已经做完一段时间，突然想起来当初留下的这个问题。

后来的解决方案主要如下：

第一，SDS loading buffer一定要按照体积加入，切勿忽视。

第二，蛋白上样量还是适当减少，上样体积也不要过多，我把20微上样体积改成了10微。主要考虑是这样跑胶的结果会比较好很多，当然对WB显色没有太多影响，毕竟抗体对目的蛋白的信号放大是数量级的。反而条带显色更好。

第三，抗体的稀释比例，对于我的实验来讲特别是内参的比例很重要，由于使用的国外比较好的公司的抗体，所以效价确实高，最后H3的考题稀释比例是1：40000。

最后有图有真相，上图给需要的朋友参考。
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4楼2014-04-24 21:07:42
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wybiology

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wybiology at 2014-04-24 21:07:42
WB已经做完一段时间，突然想起来当初留下的这个问题。

后来的解决方案主要如下：

第一，SDS loading buffer一定要按照体积加入，切勿忽视。

第二，蛋白上样量还是适当减少，上样体积也不要过多，我把20微上 ...

为什么刚才不能传图片，never mind.
见下图，
请问WB做成这样，说明人品已经极差了吗？-2
target protein.jpg


请问WB做成这样，说明人品已经极差了吗？-3
H3 .jpg
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5楼2014-04-24 21:20:55
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