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shining-rose

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助】PCR阴性对照出现条带?急!

求助各位老大,我昨天扩增细菌16 S ,23s , s  的时候阴性对照(不加模板)出现了明显的条带(加过模板的产物条带会更亮),很奇怪,我又从新做了几遍,一一换了酶,buffer,水,就剩引物没换了。原因会在哪里呢?希望各位大虾指点一下。
     
      谢谢大家参与!!
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花枝俏

铜虫 (小有名气)

引物污染了,可能是长菌了。
轻用其芒,动即有伤,是为凶器;深藏若拙,临机取决,是为利器。
2楼2008-02-28 00:03:30
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annwt

木虫 (正式写手)

★ ★
asr(金币+2,VIP+0)::P 多谢,欢迎常来交流!
我没有作过你的试验,我作过大量PCR的试验,我很感兴趣这方面的工作,我的分析是:
1,怀疑水的问题,换一瓶dd水,或其他试剂盒中带的水。
2,怀疑dNTP,buffer,没有办法换。
3,怀疑Taq酶,看其他同学作的结果中有你的带吗?
4,怀疑环境,细菌污染是常有的事,带上你的引物,换个实验室,甚至换操作人员。
遇到问题就是多作对照,比较,也许这样老板不高兴,但你要坚持,这才是学习。

[ Last edited by annwt on 2008-2-28 at 08:05 ]
3楼2008-02-28 08:04:09
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kindbillow

★ ★
asr(金币+2,VIP+0)::P 多谢。
二楼已经讲的很详尽了,我也认为是污染的问题,必须要注意实验操作时的无菌原则--总之,一切按照实验手册严格执行,至于双蒸水、Taq酶、dNTP和buffer我的经验是,用自己新蒸或新购的,别为了省事、省钱耽误了大事
4楼2008-02-28 08:37:09
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shining-rose

金虫 (小有名气)

reasonspare(金币+0,VIP+0):其实这个我经常遇到, 你只要将循环次数降到20-25,对照就没有了,就算最贵的酶 扩增16S 30-35 cycles 一样能扩对照
二楼和三楼分析的很对,谢谢你们

今天又做了,换了实验室,水,dNTP,酶,buffer。都换过了,还是有条带出现啊

也可能是Taq酶的问题,大家都知道Taq酶是从大肠杆菌纯化得来的,所以难免会有大肠杆菌基因组的残留,给公司打个电话,就说要做细菌16S扩增,问公司要超纯(也就是无基因组残留)的Taq酶

你们说呢??
5楼2008-02-28 20:42:18
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xiaoyur

金虫 (著名写手)


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie, . 期待更多精彩
如果都换了,可能是
1,交叉污染,操作是注意更换枪头

1,怀疑引物有问题,重新合成引物
我觉得新酶里残留有DNA的可能不大
爱的反义词不是恨 而是冷漠!
6楼2008-03-02 17:01:36
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人


reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie, . 期待更多精彩
因为你扩的基因保守性很强,所以只要有半点儿污染,就会扩出阳性条带。环境要超干净,以防操作中污染杂菌及DNA,另外试剂要绝对无污染。
细推物理须行乐。
7楼2008-03-02 17:16:35
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dreamsail

银虫 (正式写手)

二楼说得很详细了,但是也有可能是操作过程中的污染,虫子,做实验洗手了吗?
8楼2008-03-03 01:01:03
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Sulfolobus

新虫 (初入文坛)

枪的问题。很多人忽略了这一点。
最好换用新枪,或者把枪头部分用70%酒精清洗干净,里面也用卫生纸卷成小棍弄干净。然后用超纯水清洗多次。
一生的朋友
9楼2008-03-03 11:33:14
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)

我也遇到过这种问题,跟环境污染有问题,换个地方做PCR,或放一个礼拜再做.这个叫气液相污染,很特别.一般来说你的试剂没有问题.
10楼2008-03-03 12:42:31
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