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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】PCR阴性对照出现条带？急！
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shining-rose

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助】PCR阴性对照出现条带？急！

求助各位老大，我昨天扩增细菌16 S ,23s , s  的时候阴性对照（不加模板）出现了明显的条带（加过模板的产物条带会更亮）,很奇怪，我又从新做了几遍，一一换了酶，buffer，水，就剩引物没换了。原因会在哪里呢？希望各位大虾指点一下。
     
      谢谢大家参与！！
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1楼 2008-02-27 15:34:39
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花枝俏

铜虫 (小有名气)
引物污染了，可能是长菌了。
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轻用其芒，动即有伤，是为凶器；深藏若拙，临机取决，是为利器。
2楼2008-02-28 00:03:30
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annwt

木虫 (正式写手)
★ ★
asr(金币+2,VIP+0)::P 多谢，欢迎常来交流！
我没有作过你的试验，我作过大量PCR的试验，我很感兴趣这方面的工作，我的分析是：
1，怀疑水的问题，换一瓶dd水，或其他试剂盒中带的水。
2，怀疑dNTP，buffer，没有办法换。
3，怀疑Taq酶，看其他同学作的结果中有你的带吗？
4，怀疑环境，细菌污染是常有的事，带上你的引物，换个实验室，甚至换操作人员。
遇到问题就是多作对照，比较，也许这样老板不高兴，但你要坚持，这才是学习。

[ Last edited by annwt on 2008-2-28 at 08:05 ]
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3楼2008-02-28 08:04:09
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kindbillow

★ ★
asr(金币+2,VIP+0)::P 多谢。
二楼已经讲的很详尽了，我也认为是污染的问题，必须要注意实验操作时的无菌原则－－总之，一切按照实验手册严格执行，至于双蒸水、Taq酶、dNTP和buffer我的经验是，用自己新蒸或新购的，别为了省事、省钱耽误了大事
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4楼2008-02-28 08:37:09
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shining-rose

金虫 (小有名气)
reasonspare(金币+0,VIP+0):其实这个我经常遇到, 你只要将循环次数降到20-25,对照就没有了,就算最贵的酶 扩增16S 30-35 cycles 一样能扩对照
二楼和三楼分析的很对，谢谢你们

今天又做了，换了实验室，水，dNTP，酶，buffer。都换过了，还是有条带出现啊

也可能是Taq酶的问题，大家都知道Taq酶是从大肠杆菌纯化得来的，所以难免会有大肠杆菌基因组的残留，给公司打个电话，就说要做细菌16S扩增，问公司要超纯（也就是无基因组残留）的Taq酶

你们说呢？？
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5楼2008-02-28 20:42:18
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xiaoyur

金虫 (著名写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie, . 期待更多精彩
如果都换了，可能是
１，交叉污染，操作是注意更换枪头

１，怀疑引物有问题，重新合成引物
我觉得新酶里残留有ＤＮＡ的可能不大
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爱的反义词不是恨 而是冷漠!
6楼2008-03-02 17:01:36
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):xiexie, . 期待更多精彩
因为你扩的基因保守性很强，所以只要有半点儿污染，就会扩出阳性条带。环境要超干净，以防操作中污染杂菌及DNA，另外试剂要绝对无污染。
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细推物理须行乐。
7楼2008-03-02 17:16:35
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dreamsail

银虫 (正式写手)
二楼说得很详细了,但是也有可能是操作过程中的污染,虫子,做实验洗手了吗?
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8楼2008-03-03 01:01:03
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Sulfolobus

新虫 (初入文坛)
枪的问题。很多人忽略了这一点。
最好换用新枪，或者把枪头部分用70%酒精清洗干净，里面也用卫生纸卷成小棍弄干净。然后用超纯水清洗多次。
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一生的朋友
9楼2008-03-03 11:33:14
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
我也遇到过这种问题，跟环境污染有问题，换个地方做ＰＣＲ，或放一个礼拜再做．这个叫气液相污染，很特别．一般来说你的试剂没有问题．
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10楼2008-03-03 12:42:31
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