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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 用试剂盒通过全质粒PCR来做定点突变，导入不了感受态细胞，请帮我走出困境！
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厚德求是

木虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.

[求助] 用试剂盒通过全质粒PCR来做定点突变，导入不了感受态细胞，请帮我走出困境！ 已有5人参与

先介绍一下我的试验情况：
就像题目所说，我的试验是对蛋白质做定点突变，方法是设计突变引物，用全质粒作为模板，在突变结束完成后用选择性消化甲基化核酸的酶处理产物，然后利用热击法把核酸片段转化导入感受态细胞中。
现在的问题是，全质粒PCR是挺成功的，模板条带大小正确，明亮清晰。可是用试剂盒提供的感受态细胞做转化，就长不出单菌落，而是一大片薄薄的云雾一样的东西，师兄说不对劲，可能失败了。可是我已经重复了3次了，每次都是这种类似的情况！所以我想，是不是他的感受态有问题，现在想自己制备DH5α感受态细胞，把目标质粒导入这个感受态细胞，在它里面完成超螺旋的装备，然后再导入我的目标宿主中。
对了，我用的试剂盒是“TransGen”（貌似是北京的公司）的fast mutagenesis system，有没有用过的朋友啊？我觉得这个很不好用啊！是不是要换试剂盒啊？请了解情况和有过类似经历的朋友帮我！先谢谢了！
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1楼 2014-03-31 20:31:57
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
厚德求是: 金币+1, ★有帮助, 谢谢，第一个成功了。 2014-04-02 21:01:25
你的模板不是全质粒嘛~？那本身是什么抗性转化时就涂什么板，不是吗？另外，你试一下把感受态分成两管来做。一般买的感受态转化效率都很高的

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
7楼2014-04-02 13:00:24
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 21:44:54
“感受态细胞做转化，就长不出单菌落，而是一大片薄薄的云雾一样的东西”

你的板子抗性不行了
这个跟转化没关系

或者说，你描述的是感受态菌死了之后薄薄一层的意思？

这个薄薄一层会长么？
这家公司的感受态还可以的。
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2楼2014-03-31 20:43:45
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厚德求是

木虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-31 20:43:45
“感受态细胞做转化，就长不出单菌落，而是一大片薄薄的云雾一样的东西”

你的板子抗性不行了
这个跟转化没关系

或者说，你描述的是感受态菌死了之后薄薄一层的意思？

这个薄薄一层会长么？
这家公司的感 ...

我的板子没加抗生素，做感受态还敢那种东西。。。感受态细胞是公司连着突变试剂盒一起给我的，涂到板子上之后，没有想象中的单菌落，而是一片东西，明显是长过了的结果，不是没长，也不是长了死了，而是很奇怪的菌体形态。师兄说，不是单菌落的话不对劲，可能失败了。我想等到明天，在那个上面划一道，加入LB培养一下，提质粒，看看到底是成功了没有。
你做过突变吧？感受态细胞涂板子之后长出来的是什么形态是正确的？
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3楼2014-03-31 20:52:49
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
厚德求是: 金币+1, ★有帮助, 谢谢您的回答 2014-04-01 00:09:27

什么高级转化，不加抗性筛选？
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4楼2014-03-31 20:58:20
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