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sky_x1227

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 2515853
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性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 液相色谱反向C18柱分离多肽流动相的选择问题已有1人参与

大家好，我用液相色谱分离多肽，选用的是反向C18的柱子，我的蛋白是水溶性的蛋白，反向C18因其调料为非极性的键合相不能承受纯水做流动相，咨询下大家最常用的是选用什么样的有机溶剂，又不对蛋白样品有什么损伤，希望有经验的童鞋给些建议。越详细越好噢~

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虫子

1楼 2014-03-28 18:22:56

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xuyunjian

铁虫 (小有名气)

应助: 96 (初中生)
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虫号: 3266954
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专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

首先应该能与样品溶液有很好的相溶性，且洗脱能力要比样品的稀释液的洗脱能力强，一般最好流动相与稀释液一样。
再者流动相与稀释液不应再样品的紫外吸收波长处有吸收，一般有机溶剂首选乙腈，因为在1.0ml/min条件下，乙腈与水溶液混溶时压力变化不是很大，不会影响柱子的使用寿命。再者，乙腈的紫外吸收截止波长较短（在210nm左右）。
再者就是有机溶剂的黏度了，黏度太大会增大柱压，就黏度而言，乙腈、甲醇是首选。
流动相一般为缓冲盐与有机相的混合液。有机溶剂中能与缓冲盐有很好的相溶性的就数乙腈和甲醇了。
根据你的分析物质的不同，流动相的极性的要求也不同，这时需要通过不断地调节有机相的比例来获得很好的分离度、出峰时间、峰形的对称性、等等。
如果你分析的物质是中性的分子或非解离型物质，这时的流动相用流动相与超纯水的混合液即可。如果样品溶液中有离子的其他物质的干扰，此时就需要调节流动相中缓冲盐的pH了。怎么确定你分析的物质中存在离子或其他干扰物质的存在呢？用如下办法可以确定有无离子或干扰物质的存在影响分析——在同样的色谱条件下每批样品的分析结果不能很好的重现，或者说分离效果不明显。
如果是解离性的物质，则流动相为有机相与缓冲盐的混合液，且流动相中的缓冲盐则必须调节pH,不然分析效果肯定不理想。一般pH与样品主成分的pKa之差大于2，才能获得较好的分离效果。
现在一般的C18色谱柱，能耐受的pH范围是2-8，也有范围更宽的，可以参照色谱柱说明书。所以流动相中添加磷酸、甲酸、乙酸什么的都没有任何问题，只要pH在耐受范围即可。但是，选择流动相添加剂也是有讲究的，比如你方法选用的波长是210nm，那么最好不要用甲酸乙酸，因为甲酸乙酸的截止波长大于210nm，会造成基线漂移严重；另外，如果你流动相的pH是4.0，那么不建议使用磷酸盐，因为磷酸盐/磷酸在pH4.0附近是没有缓冲能力的，流动相的pH很容易发生变化，导致出峰重现性差。