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caiqingchong

木虫 (著名写手)

[交流] 我克隆的基因为什么总是不能表达?

我克隆了三个酶,载体为pet28a,转化入E.coli Bl21中,在37°C、50/250ml三角瓶中诱导表达。分别用终浓度为)0.1 , 0.5和1毫摩的IPTG诱导4h,蛋白电泳,其中两个无特异带,重复过2次,均未出现特异带,但有一个有带,说明IPTG和E.coli Bl21没有问题。基因经过测序,正确。
我想知道,为什么基因不能表达,可以如何 处理才可能表达?谢谢!
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caiqingchong

木虫 (著名写手)

谢谢各位了,又诱导了几批,还是不出蛋白,25,30,37度,IPTG0.2,0.4,0.6,0.8,1mM条件下都不行,只是还没有试诱导菌体浓度,做过OD6000.5-1.1之间的几次,也还是不行。基因内部有几个稀有密码子,但没有连在一起。难道真的要换载体不行?还有什么法子啊?
9楼2008-03-05 14:32:36
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jjg0912

木虫 (正式写手)


guohuayin(金币+1,VIP+0):谢谢给予帮助!请 继续努力!
先把菌摇起来再加的IPTG,再考虑一下温度,最后再看看你的基因序列内部又没有终止密码子/稀有密码子。
2楼2008-02-25 21:16:29
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

首先确定你的序列没有问题。
很多因素都会影响诱导表达
1。什么时候诱导?就是你的菌培养到多少OD600。不同的基因是不一样的,我曾经做过一个基因要在0.3左右诱导才表达
2。诱导是IPTG的用量
3。诱导温度
4。培养基的pH值也会影响
5。诱导时间,就是加入IPTG多少时间之后收集。
总之,具体的条件都要你自己摸索,多做几个小量诱导的平行实验,试试不同的条件。找到合适了,在扩大培养。
4楼2008-02-26 10:16:13
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

低温诱导试验下!
5楼2008-02-26 10:17:46
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