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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 我克隆的基因为什么总是不能表达？
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caiqingchong

木虫 (著名写手)

[交流] 我克隆的基因为什么总是不能表达？

我克隆了三个酶，载体为pet28a，转化入E.coli Bl21中，在37°C、50/250ml三角瓶中诱导表达。分别用终浓度为）0.1 , 0.5和1毫摩的IPTG诱导4h，蛋白电泳，其中两个无特异带，重复过2次，均未出现特异带，但有一个有带，说明IPTG和E.coli Bl21没有问题。基因经过测序，正确。
我想知道，为什么基因不能表达，可以如何 处理才可能表达？谢谢！
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1楼 2008-02-25 19:59:00
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jjg0912

木虫 (正式写手)
★
guohuayin(金币+1,VIP+0):谢谢给予帮助！请 继续努力！
先把菌摇起来再加的IPTG，再考虑一下温度，最后再看看你的基因序列内部又没有终止密码子/稀有密码子。
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2楼2008-02-25 21:16:29
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx,如果有详细的介绍就好了
18度诱导试试
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3楼2008-02-25 21:53:31
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)
首先确定你的序列没有问题。
很多因素都会影响诱导表达
1。什么时候诱导？就是你的菌培养到多少OD600。不同的基因是不一样的，我曾经做过一个基因要在0.3左右诱导才表达
2。诱导是IPTG的用量
3。诱导温度
4。培养基的pH值也会影响
5。诱导时间，就是加入IPTG多少时间之后收集。
总之，具体的条件都要你自己摸索，多做几个小量诱导的平行实验，试试不同的条件。找到合适了，在扩大培养。
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4楼2008-02-26 10:16:13
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
低温诱导试验下！
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5楼2008-02-26 10:17:46
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wangjun0457

银虫 (小有名气)
我也用pET28a表达过好几种蛋白。但跟楼主不一样我经常碰到包涵体。
如果我是你的话，我首先会延长表达时间。
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6楼2008-02-26 10:52:53
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jfchang

新虫 (初入文坛)
既然质粒测序都没有问题，就该考虑换宿主菌了，现在普遍使用的BL21菌株只添加了pLysS质粒，而它的改进型rosetta当中添加了所有7种原核细胞的稀有密码子tRNA，已经完全克服了真核蛋白在原核表达种的问题。
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7楼2008-03-04 12:08:36
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xiaoyur

金虫 (著名写手)
可以仔细看看PET表达手册
然后考虑
1 ,稀有密码子过多,用Rosseta菌株
2, 蛋白酶是否影响细菌生长，用ＢＬ２１plysＳ

3,做RT-PCR,看有没有转录
4,预测mRNA的二级结构，有时二级结构也影响表达
5,试试别的载体，
原核表达有时候靠不断的摸索，寻找各种因素的最佳组合．
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爱的反义词不是恨 而是冷漠!
8楼2008-03-04 14:14:08
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caiqingchong

木虫 (著名写手)
谢谢各位了，又诱导了几批，还是不出蛋白，25，30，37度，IPTG0.2，0.4，0.6，0.8，1mM条件下都不行，只是还没有试诱导菌体浓度，做过OD6000.5-1.1之间的几次，也还是不行。基因内部有几个稀有密码子，但没有连在一起。难道真的要换载体不行？还有什么法子啊？
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9楼2008-03-05 14:32:36
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caiqingchong

木虫 (著名写手)
都快郁闷死了，做这几个基因从克隆就一波多折，下载克隆好了，怎么就是不表达啊，搞了好长时间了，快要崩溃了！
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10楼2008-03-05 14:34:57
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