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renkeyixin

新虫 (初入文坛)

[求助] 包涵体用TGE缓冲液透析复性需要加尿素吗 已有1人参与

8M尿素溶的包涵体，过了NI柱，透析复性时看到大家有用TGE缓冲液，我想问下需要在TGE缓冲液中加入尿素梯度透析吗
还是直接用TGE缓冲液多换几次就可以了
TGE缓冲液配方 ph 7.9
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%
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1楼 2014-03-27 10:10:47
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lpzl

木虫 (正式写手)
同求同求。。。
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2014-03-27 11:14:33
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Davie_Meagen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+10, 应助指数+1, 鼓励新虫发帖交流 2014-03-28 13:53:04
要在TGE缓冲液中加入尿素梯度透析，建议先把蛋白浓度降到0.5mg/ml以下再透析，不过透析会有不同程度的沉淀，有沉淀要及时离心去除沉淀再继续透析。
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3楼2014-03-28 12:35:26
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renkeyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Davie_Meagen at 2014-03-28 12:35:26
要在TGE缓冲液中加入尿素梯度透析，建议先把蛋白浓度降到0.5mg/ml以下再透析，不过透析会有不同程度的沉淀，有沉淀要及时离心去除沉淀再继续透析。

一般尿素梯度的话最低是到2M吗，那最后透析完蛋白浓度降低了，我要是浓缩的话，里面的盐离子浓度还有甘油尿素的浓度不都升高了啊，请问你具体是怎么透析的啊
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4楼2014-03-31 20:44:17
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Davie_Meagen

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by renkeyixin at 2014-03-31 20:44:17
一般尿素梯度的话最低是到2M吗，那最后透析完蛋白浓度降低了，我要是浓缩的话，里面的盐离子浓度还有甘油尿素的浓度不都升高了啊，请问你具体是怎么透析的啊...

透析和超滤浓缩以后，盐离子浓度和甘油尿素的浓度不升高，他们都是小分子，可以和水一起透过去。一般尿素梯度从8M到4M到2M，0.2mg/ml蛋白样品和透析溶液的比例大概1:10，透析5~6个小时换一次溶液。到2M以后也可以再降低到1.5M或者1M，可能会有沉淀损耗，有沉淀要及时离心去除沉淀再继续。你试一试吧，可能会失败。
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5楼2014-04-01 08:20:06
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renkeyixin

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by Davie_Meagen at 2014-04-01 08:20:06
透析和超滤浓缩以后，盐离子浓度和甘油尿素的浓度不升高，他们都是小分子，可以和水一起透过去。一般尿素梯度从8M到4M到2M，0.2mg/ml蛋白样品和透析溶液的比例大概1:10，透析5~6个小时换一次溶液。到2M以后也可以再 ...

我是说透析完的话蛋白浓度肯定会降低不，这就需要浓缩，这样的话，盐离子浓度和甘油尿素的浓度都升高了啊
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6楼2014-04-01 08:38:44
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Davie_Meagen

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by renkeyixin at 2014-04-01 08:38:44
我是说透析完的话蛋白浓度肯定会降低不，这就需要浓缩，这样的话，盐离子浓度和甘油尿素的浓度都升高了啊...

不明白？？浓缩为什么，盐离子浓度和甘油尿素的浓度都升高了？？你是用什么方法浓缩的？？
我们做的超滤浓缩只浓缩蛋白，盐离子浓度和甘油尿素的浓度都不升高。
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7楼2014-04-01 09:38:33
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renkeyixin

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by Davie_Meagen at 2014-04-01 09:38:33
不明白？？浓缩为什么，盐离子浓度和甘油尿素的浓度都升高了？？你是用什么方法浓缩的？？
我们做的超滤浓缩只浓缩蛋白，盐离子浓度和甘油尿素的浓度都不升高。...

真空浓缩，没有用超滤浓缩
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8楼2014-04-01 15:10:31
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renkeyixin

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Davie_Meagen at 2014-04-01 09:38:33
不明白？？浓缩为什么，盐离子浓度和甘油尿素的浓度都升高了？？你是用什么方法浓缩的？？
我们做的超滤浓缩只浓缩蛋白，盐离子浓度和甘油尿素的浓度都不升高。...

是直接把蛋白放在透析袋然后用含尿素的TGE缓冲液梯度透析吗?还是需要加什么其他的试剂什么的
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9楼2014-04-01 15:46:57
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Davie_Meagen

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9楼: Originally posted by renkeyixin at 2014-04-01 15:46:57
是直接把蛋白放在透析袋然后用含尿素的TGE缓冲液梯度透析吗?还是需要加什么其他的试剂什么的...

你先试试吧。我也很久没做过这样的课题了。祝你好运。
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10楼2014-04-01 17:45:46
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