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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 单增李斯特核酸提取及PCR扩增灵敏
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波波斯猫

新虫 (初入文坛)

[求助] 单增李斯特核酸提取及PCR扩增灵敏 已有1人参与

各位有做过单增李斯特DNA提取的吗，这种革兰氏阳性菌用什么方法提取效率比较高。
我原菌液计数后大约有109CFU/ml，用pbs梯度稀释成10-1到10-7，稀释后的菌液取1ml离心收集菌体后提取，再做PCR
发现只能加成到10-3的，那就意味着PCR灵敏度为106CFU/ml
和很多文献报道的几十个或几千个差距很大
我实在搞不明白是什么原因，我选择的基因是hlyA基因。
不知道是因为提取的问题，还是引物的为，求助ing
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1楼 2014-03-24 13:59:01
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波波斯猫

新虫 (初入文坛)
实际上我还想知道是否可能存在文献报道不实的现象
有些文献报道把样本稀释到很低浓度后，用煮沸法，就能做出每个反应几十个CFU的数据
但是我觉得当菌浓度太低的时候，提取就是个问题啊
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3楼2014-03-24 14:24:51
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
波波斯猫(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-03-24 15:15:15
背景提供的不够，如果你想和报道的文献比较结果，那么就要尽可能的和文献的方法，材料，操作，计算一致才可以比较。
如果觉得是引物问题，用同样的模板，用你现在的引物和文献的引物做对照实验接可以知道原因，
如果觉得是提取的问题，那么用不同的方法提取，用同样的引物做对比实验，也可以知道原因。
Good Luck!
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2014-03-24 14:14:40
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波波斯猫

新虫 (初入文坛)
有做过相关数据的，欢迎提供操作方法
特别是针对低浓度细菌的提取方法   有些提取试剂盒都要求细菌量达到106次以上的
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4楼2014-03-24 14:26:08
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波波斯猫

新虫 (初入文坛)
革兰氏阳性菌 用点溶菌酶是不是比较好  我在原始的提取方法前，加入溶菌酶终 1mg/ml ，37度处理1h后，发现结果没有什么改善啊
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5楼2014-03-24 14:28:52
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