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酷炫飙车

金虫 (小有名气)

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注册: 2012-11-14
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 钙离子诱导转化问题

钙离子诱导大肠杆菌转化一直失败，想问一下有什么原因。实验条件如下：
1、取rossetta gami 2菌制备感受态细胞。
2、100微升感受态悬液加入10微升质粒冰浴30分钟。
3、42℃热激2min。
4、快速冷却3min。
5、加入400微升LB液体培养基，37℃温育1h15min。
6、取100微升涂布在含有Amp和氯霉素的平板上37℃倒置培养过夜。
结果：不生长
已知rossetta gami 2菌为氯霉素抗性，另外质粒为以Pet32a质粒为载体的重组质粒（含有Amp抗性基因）。
另外做了BL21的对照组，按上述转化条件，质粒成功转入BL21中并表现Amp抗性。

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1楼 2014-03-12 09:32:23

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

王平阳

金虫 (正式写手)

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性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

过程没有问题，鉴于你做了对照，问题可能出现在rossetta gami 2菌上，如果制备感受态没有问题，可能有以下几个原因：
1、并不是所有大肠杆菌都适合做克隆的，你为何不选用常见的菌株呢。
2、不同的菌生长条件、生长时间是不一样的，建议好好查询一下该菌的最适生长条件，例如农杆菌，最适生长温度是28°C，而非37°C，除了添加质粒抗生素，还要加利福平，所以好好查询一下。
3、普通转化不行，你可以试试电转，可能会有效果。
以上鄙人拙见，见供参考！

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没有做不到，只有想不到！

2楼2014-03-16 13:49:19

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