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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » ATP对蛋白稳定性的影响
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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] ATP对蛋白稳定性的影响

在做蛋白与tRNA的binding实验时，加了ATP导致蛋白沉淀，ATP浓度为10mM，加AMP或AMPPNP代替，情况稍微好一点，但也有部分沉淀。因为没有加氨基酸，所以应该还没有反应，是因为静电作用或是空间位阻的原因引起蛋白构型发生较大变化而沉淀吗？还请各位了解tRNA氨酰化过程的帮忙分析下原因呀。。。
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1楼 2014-03-05 15:33:17
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-07 12:42:34
1.复合物等电点不一定是两者等电点的平均值，因为滴定曲线本身就不是线性的，我之前的例子就是打个比方而已。
2.有可能是你说的那样，但是不能肯定，也有可能是有构象变化什么的。

看你的问题，我感觉我们是同行 ...

不知道蛋白的结构的情况下，很难确定它的表面带电，都不好确定应该在什么样的pH条件下进行binding实验了，看样子以后ATP,tRNA 溶液都得调pH到中性再用了，之前没想到酸性这么大，都只是用tri-HCl或Hepes配制后直接用。
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16楼2014-03-07 12:50:29
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
笔冰河: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-03-06 16:49:08
笔冰河: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-03-06 19:53:37
蛋白能与RNA结合，说明蛋白表面是带正电的，ATP是酸性的，加了ATP导致酸碱中和，降低了蛋白质的溶解度，所以沉淀。
ATP的酸性很强，请问你配制ATP时有没有用NaOH调pH值啊？最好把ATP调成近似中性的，吸一微升用pH试纸检测就行。
如果还不行的话，可能要改变一下蛋白所处缓冲液的pH值。
如果还不行的话，考虑增加一下离子强度，总之问题应该是出在蛋白溶解度上，往这个方向改进实验应该会有帮助。

希望对你有帮助。
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2楼2014-03-05 18:25:40
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-05 18:25:40
蛋白能与RNA结合，说明蛋白表面是带正电的，ATP是酸性的，加了ATP导致酸碱中和，降低了蛋白质的溶解度，所以沉淀。
ATP的酸性很强，请问你配制ATP时有没有用NaOH调pH值啊？最好把ATP调成近似中性的，吸一微升用pH试 ...

我的ATP溶液是直接用pH7.6的tris-HCl溶解粉末配制的，溶解后没有调pH。
NaCl浓度为100mM,离子浓度高于100mM tRNA无法binding到蛋白上，但这个离子浓度下蛋白又不稳定，容易聚集沉淀，好纠结啊。。
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3楼2014-03-06 18:30:35
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-05 18:25:40
蛋白能与RNA结合，说明蛋白表面是带正电的，ATP是酸性的，加了ATP导致酸碱中和，降低了蛋白质的溶解度，所以沉淀。
ATP的酸性很强，请问你配制ATP时有没有用NaOH调pH值啊？最好把ATP调成近似中性的，吸一微升用pH试 ...

重新测了一下ATP溶液的pH, 发现用pH7.6tris-HCl溶解的ATP，只有pH3左右，额。。。原来都还没到tris的缓冲区间，难怪一加蛋白就沉，非常感谢大侠的解答，帮我解决了纠结一个多月的问题。。。
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4楼2014-03-06 19:57:13
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