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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » FAM-miRNA转染小鼠骨髓间充质干细胞观察不到荧光
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米老鼠的树

银虫 (小有名气)

[求助] FAM-miRNA转染小鼠骨髓间充质干细胞观察不到荧光 已有3人参与

本人用FAM-miRNA转染mMSCs，转染试剂是用的Invitrogen公司的lipo2000，转染步骤也是按照说明书做的。lipo2000和miRNA孵育的过程用的是不含血清的完全培养基而不是优化培养基，但这个影响不大吧？也说可以用不含血清的完全培养基的对吧~接种的细胞的密度是4万/孔（24孔板）。孵育了4~5个小时，用荧光显微镜观察，看不到荧光，但是背底的荧光很强。FAM-miRNA是用的公司合成的，应该没问题。想请教一下各位，问题出在哪儿了？再有，想请教一下大家干细胞转染与其他细胞转染的一些区别，因为看资料干细胞转染要比其他细胞类型难一些对吧？谢谢各位啦~~
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peace
1楼 2014-02-25 11:10:20
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-25 21:52:00
米老鼠的树: 金币+2, ★有帮助 2014-02-26 12:56:54
1、很多细胞用lip2000转染效率不高，MSC的效率应该非常低。
2、lip2000转染不能含有双抗，转到细胞内可能对细胞有害。
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4楼2014-02-25 15:38:07
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ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-25 13:01:43
米老鼠的树: 金币+3, ★有帮助 2014-02-26 12:57:06
建议先试下一般的荧光载体转染实验。这样可以熟悉下显微镜操作、转染流程等等的。
另外我一般是转染24h以后再看细胞荧光的。有些细胞系是比较难转染或是难表达外源基因的，这个也是必须承认的
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2楼2014-02-25 12:56:35
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米老鼠的树

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ifyousee at 2014-02-25 12:56:35
建议先试下一般的荧光载体转染实验。这样可以熟悉下显微镜操作、转染流程等等的。
另外我一般是转染24h以后再看细胞荧光的。有些细胞系是比较难转染或是难表达外源基因的，这个也是必须承认的

谢谢。我也试过24h的，也是观察不到荧光。
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peace
3楼2014-02-25 14:46:32
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alxz

铁杆木虫 (职业作家)

其实我是一只大老鼠

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-25 21:52:10
米老鼠的树: 金币+5, ★有帮助 2014-02-26 12:56:40
你用的是带荧光的miRNA，而非细胞自发荧光
用荧光显微镜观测前，要排除载miRNA的liposome的干扰

建议观测时间定为8h，观测前换液操作中多用PBS洗几次细胞
如果miRNA已进入细胞的话，洗涤多次也不会影响
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风起，夜未央~流年，乱浮生
5楼2014-02-25 20:29:22
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