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xiaoyu0127铜虫 (小有名气)
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流式 已有1人参与
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本人想请教：我打算确认购买的某PE标记抗体的作用，所以打算做一个简单的过程：收细胞-抗体孵育-上流式细胞仪，但是第一次，所以有一些问题还需要请教大家，希望见谅： 1.一般上流式会用到固定剂，请问我这种情况需要吗； 2.实验过程是不是：加刺激到一定时间--用PBS洗2次--弃上清--用100ul含2％BSA的PBS稀释20ul PE流式抗体， 4C避光旋转混匀过夜--预冷PBS洗3遍，用400 ulPBS重悬后，用流式检测和数掘分析，每次计数5000个细胞。 希望大家不吝赐教，不足的地方也请多多包涵  另外，流式细胞的图我目前只能看个大概，如果能分享一些专业的文件，不胜感激 [ Last edited by silicare on 2014-2-22 at 18:45 ] |
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yang0071
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2楼2014-02-21 22:28:05
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xiaoyu0127: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-22 14:29:39
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xiaoyu0127: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-22 14:29:39
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1、看你的要求，不是都要固定的，不固定的图形会好看。 但有的染色是必须固定的，所以还是要看你的要求，做的是什么，看高分文章中那些个牛的实验室他们的条件是什么。 2、Buffer可以用PBE（PBS+FBS(BSA)+EDTA)，会好一点。抗体染色看说明书，不是一定要染那么长时间的，长时间有时会出现假阳性。大多数抗体 4度半小时就好了。 至于计数看你的要求了，我们有次做白血病环境中造血干细胞的周期。如果算下来好像记的P2还是P3的数，这还计了不止10万个细胞，那个图也不好看，没几个细胞，还想多记些。那个保存的文件很大。。。 重悬体系不要太大，要不很费时间100-200就好。当然用来圈门的多一点好，要不损失细胞太多，不够折腾的 抗体有钱就买BD的，差点买ebioscience的，再差买biolegend。 据说是一个人做的，做大了卖了。我们主要试过前两个的效果差不多。 除了像PerCp-Cy5.5之类的很偏的染料，BD确实好，其他的像什么PE、FITC、PE-Cy7什么的差不多。没必要费银子。 |
3楼2014-02-22 00:53:12
xiaoyu0127
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xiaoyu0127
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7楼2014-02-23 21:59:48