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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)

[求助] 流式 已有1人参与

本人想请教：我打算确认购买的某PE标记抗体的作用，所以打算做一个简单的过程：收细胞-抗体孵育-上流式细胞仪，但是第一次，所以有一些问题还需要请教大家，希望见谅：
1.一般上流式会用到固定剂，请问我这种情况需要吗；
2.实验过程是不是：加刺激到一定时间--用PBS洗2次--弃上清--用100ul含2％BSA的PBS稀释20ul PE流式抗体， 4C避光旋转混匀过夜--预冷PBS洗3遍，用400 ulPBS重悬后，用流式检测和数掘分析，每次计数5000个细胞。
希望大家不吝赐教，不足的地方也请多多包涵
另外，流式细胞的图我目前只能看个大概，如果能分享一些专业的文件，不胜感激

[ Last edited by silicare on 2014-2-22 at 18:45 ]
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1楼 2014-02-21 21:52:23
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yang0071

木虫 (职业作家)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 应助指数-1, 谢谢参与，不过非应助 2014-02-22 06:52:12
你就这么不信任你买试剂的公司吗
好好干你该干的活
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2楼2014-02-21 22:28:05
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wizardfan: 金币+2, 应助指数+1, 谢谢应助 2014-02-22 06:52:36
xiaoyu0127: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-22 14:29:39
1、看你的要求，不是都要固定的，不固定的图形会好看。  但有的染色是必须固定的，所以还是要看你的要求，做的是什么，看高分文章中那些个牛的实验室他们的条件是什么。
2、Buffer可以用PBE（PBS+FBS(BSA)+EDTA)，会好一点。抗体染色看说明书，不是一定要染那么长时间的，长时间有时会出现假阳性。大多数抗体 4度半小时就好了。
至于计数看你的要求了，我们有次做白血病环境中造血干细胞的周期。如果算下来好像记的P2还是P3的数，这还计了不止10万个细胞，那个图也不好看，没几个细胞，还想多记些。那个保存的文件很大。。。
重悬体系不要太大，要不很费时间100-200就好。当然用来圈门的多一点好，要不损失细胞太多，不够折腾的
抗体有钱就买BD的，差点买ebioscience的，再差买biolegend。 据说是一个人做的，做大了卖了。我们主要试过前两个的效果差不多。 除了像PerCp-Cy5.5之类的很偏的染料，BD确实好，其他的像什么PE、FITC、PE-Cy7什么的差不多。没必要费银子。
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
3楼2014-02-22 00:53:12
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2014-02-21 22:28:05
你就这么不信任你买试剂的公司吗
好好干你该干的活

不是的，是第一次做，应该先做一个阳性实验确认自己流程正确啊，说明书上也建议测一次，呵呵，让你见笑了
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4楼2014-02-22 14:01:36
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by telomerase at 2014-02-22 00:53:12
1、看你的要求，不是都要固定的，不固定的图形会好看。  但有的染色是必须固定的，所以还是要看你的要求，做的是什么，看高分文章中那些个牛的实验室他们的条件是什么。
2、Buffer可以用PBE（PBS+FBS(BSA)+EDTA)， ...

谢谢耐心解答，我理解了一下，这位虫友的意思大致如下：
1.细胞最好多些，重悬体系小些（部分稀释用来圈门）
2.我这个实验是比较简单的，细胞受刺激后，我的目的蛋白会在细胞表面表达，然后用PE标记的抗体去染，当场就测，这样是不是不用固定？一般是不是涉及到保存细胞内部的抗原状态才需要？
3.一般的流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3，不知道虫友的EDTA的作用是什么？只是稀释流式抗体加吗，还是您做其他抗体实验的抗体稀释液配方
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5楼2014-02-22 14:29:27
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
1、就是这个意思
2、如果来得及上机，我觉得没必要固定。
3、EDTA是为了防止细胞粘连，上机，重悬我们都用这个
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
6楼2014-02-23 20:35:48
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xiaoyu0127

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by telomerase at 2014-02-23 20:35:48
1、就是这个意思
2、如果来得及上机，我觉得没必要固定。
3、EDTA是为了防止细胞粘连，上机，重悬我们都用这个

非常感谢
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7楼2014-02-23 21:59:48
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