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laisforever

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[求助] 引物设计已有3人参与

我目前在做PCR的引物，需要在目的基因上面加上2个限制性内切酶，以及3-4个保护序列
我的问题就是限制性内切酶是不是应该放在目的基因的两侧，以下规格：3-4保护序列+内切酶1+目的基因+内切酶2，这个而后面还需不需要再加上3-4个保护序列？
希望知道的帮忙解决一下，谢谢

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人生在世，俯仰之间，唯有追求卓越，但求尽其所能.

1楼 2014-02-19 15:54:03

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jiaolong11a

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励回帖交流！ 2014-02-19 17:21:44

建议看看
1、添加保护碱基的目的
　　
　　在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。因此在设计PCR引物时，为保护5`端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。
　　
　　2、首先要明确什么是保护碱基
　　
　　限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
　　
　　3、添加保护碱基的原则
　　
　　添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
　　
　　添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
　　
　　一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
　　
　　添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
　　
　　为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
　　
　　4当在引物5’端添加酶切位点时要考虑：
　　
　　a）该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。
　　
　　b）如果打算PCR后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。
　　
　　如果不设计保护碱基，则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq酶的选择，若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。
　　
　　当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。