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jiaolong11a

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励回帖交流! 2014-02-19 17:21:44
建议看看
1、添加保护碱基的目的
  
  在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。但实验证明,大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基,才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。因此在设计PCR引物时,为保护5`端外加的内切酶识别位点,人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高酶切时的活性,使酶切完全。
  
  2、首先要明确什么是保护碱基
  
  限制性内切酶识别特定的DNA序列,除此之外,酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基,这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的,被称为保护碱基。
  
  3、添加保护碱基的原则
  
  添加保护碱基,需要考虑两个因素:一是碱基数目,一是碱基种类。
  
  添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点,添加几个保护碱基,是有数据可以参考的。
  
  一般情况下,普通的内切酶只加入两个保护碱基,其内切反应就可以正常进行;而有一类,仅仅只加入两个保护碱基,其内切反应就不能正常进行,这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。如NdeI就属这类,需要加入至少6个保护碱基,常用的HindIII也要三个。
  
  添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小,GC%较低,添加时多加G或C,反之亦反。
  
  为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。
  
  4当在引物5’端添加酶切位点时要考虑:
  
  a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点,这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。
  
  b)如果打算PCR后直接酶切,不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基,不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。
  
  如果不设计保护碱基,则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上,这时要注意Taq酶的选择,若想在目的序列上附加上并不存在的序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物5'端而不影响特异性。
  
  当计算引物Tm值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。

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多情总被无情扰。。。愁
2楼2014-02-19 16:48:54
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