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蒲睛琉弈

新虫 (初入文坛)

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专业: 药物毒理

[求助] 求助：猴的外周血淋巴细胞培养问题已有1人参与

最近在做猴的外周血淋巴细胞转化实验，作为新手，有很多问题要向各位有经验的朋友请教。
我用的是TBD的猴单个核细胞分离液。无菌注射器采血，转移至15mL离心管后进行分离。组织稀释液1:1稀释后，转移至淋巴细胞分离液上层，2000rpm离心30min。离心后有的看不出来白细胞层，就吸出大部分中间白色雾状层。加洗涤液1500rpm离心10min，沉淀重复洗涤2次。1640培养基重悬种板用于PHA刺激的转化实验。
我的问题主要在于：
1.将血液加到淋巴细胞分离液上层离心后，很多时候都看不到明显的白细胞层。而且中间分离液层有些悬有红细胞，这样提取的就混有较多红细胞。如何才能较少红细胞的量？
2.在细胞种板后我发现几乎每个孔都有杆状的东西，应该是细菌。。作为细胞族这是无法容忍的呀。请问各位有经验的大神，如何才能保证无菌？因为我的PBMC分离过程中都是细胞房外，这个过程有哪些步骤应该注意以防染菌？配制肝素钠抗凝剂的时候我没有用无菌水。。在称量肝素钠和PHA的时候这些药物都是暴露在空气中的，会不会也会增加染菌的几率呢？
3.可能因为染菌，我的PHA 10μg/mL刺激72h后细胞增殖率才＞100%，并没有达到文献报道的200%~300%或更高。请问各位做过这个实验的朋友一般PHA刺激60多个小时和72个小时有没有差别？PHA刺激的话增殖率的正常范围是多少？

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