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1楼2011-03-27 22:08:43

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西瓜

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“彗星”分析法在放射生物学中的应用
来源：广东医学杂志点击数：196 更新时间：2007-4-25 文章录入：Admin
“彗星”分析法在放射生物学中的应用
贺玉香综述夏云飞审校
中山大学肿瘤防治中心放疗科(广州 510060)
“彗星”分析法（comet assay）又叫单细胞凝胶电泳（single cell gel eletrophoresis, SCGE）或微凝胶电泳，是一种比较理想的单细胞水平检测哺乳类有核细胞DNA损伤的新技术。由Ostling等［1］1984年首次提出，后经Singh等［2］逐渐改进。现主要分为中性SCGE和碱性SCGE。其原理如下：去污剂或高盐裂解溶液破坏细胞膜，使得95%以上的蛋白质及细胞内其他成分渗出膜进入溶解液，DNA由于相对分子质量大而留在原位。电泳时小的DNA断片在电场作用下移出细胞核。经溴乙啶染色后在紫外线(uv)照射下发出荧光，每个受损的细胞均呈现 “彗星”外观，明亮的头部为细胞核，一系列的DNA断片组成“彗尾”。未受损的细胞只有“彗核”而无“彗尾”。DNA断片迁移的距离与DNA断片分子质量和电荷数相关，DNA断片越多、越小，“彗尾”越长，又因荧光染料与DNA的结合是特异性的，因此，通过测定 “彗星”尾部长度和荧光强度可推测DNA链断裂情况。如为中性裂解液加上50 ℃的处理只能破坏DNA超螺旋结构，而DNA双螺旋结构保存完好，只有小的双链片段在电场作用下移出细胞核，形成 “彗星”尾部，故主要用于DNA双链断裂的检测。而碱性SCGE中用碱性裂解液（pH>123）处理细胞，不但使细胞内蛋白成分更彻底地分离，也有利于DNA双螺旋破坏和单链片段移行，故用于检测DNA单链断裂。
此法的突出优点是灵敏度高。它可以测出每1657×10－17 kg中01个DNA的断裂，甚至检出自然光照体外淋巴细胞1 h引起的DNA损伤［3］。故可研究低剂量下的生物效应。其次，它能对单个细胞进行分析，故适用于体内、体外、不同实验室、不同细胞的研究。此外，此法还具有所需细胞样本数少（<10 000 个）、无需同位素标记、快速、简便、经济等优点。但是，此方法也存在一定的局限性。最为突出的是用于测量DNA损伤的几个重要参数不可能标准化［4］。目前测量的指标较多，主要有尾长、尾力矩、尾部DNA百分数、尾惯量等，但每一指标的应用均有它的局限性。尾力矩为现常用的较灵敏指标。另一个问题是 “彗星”图像有可能被饱和。此外，SCGE实验结果还受电泳的电压及时间、碱化处理条件及细胞数等多个因素的影响。因此，在严格控制影响因素后，才能使SCGE在检测中发挥优势。近年该实验已广泛用于放射生物学、遗传毒理、生物监测及肿瘤发病机制等多个领域。笔者着重介绍该技术在放射生物学领域的应用。
1应用
11检测各种辐射所致的DNA损伤单链断裂是DNA辐射损伤的最敏感指标，双链断裂是引起生物学效应的主要原因。不同品质的射线所致的损伤类型不同，如高LET射线引起双链断裂为主，低LET射线以致单链断裂为主，而uv以引起碱基损伤为主。随着射线LET的升高，单链断裂减少，双链断裂增多。故可以通过检测DNA损伤的不同类型来评价射线的生物学效应。
111DNA单、双链断裂碱性SCGE是检测DNA单链断裂最灵敏的指标［5］，通常用SCGE测到的DNA断裂与剂量呈线性关系。取射线处理后的标本在４*!℃ 条件下操作，直到荧光显微镜观察。其目的是在低温条件下抑制DNA修复的酶活性，使断裂的DNA能得以保留至最后分析。根据“彗星”图像出现的情况就能准确测到某种射线是否造成DNA断裂及断裂情况。在中性环境下裂解、电泳后所测到的“彗星”图像则可代表DNA双链断裂情况，因为双链断裂比单链断裂出现的机率少25～40倍，故所用射线的剂量应大，并且要用严格的裂解液，检出双链断裂的最少剂量是5 Gy。Olive等［6］证实了5～300 Gy的范围内“彗星”法检测到的双链断裂也与剂量呈线性反应关系。
112检测DNA-DNA链间交联、链内交联及DNA-蛋白质交联（DPC）辐射损伤致DNA链间交联不如化学损伤多，但也能发生。其检测方法有两种：一是延长电泳时间，使对照组出现“彗星”影像，而处理组DNA迁移距离反而短于对照组。此法可检出多种交联形式。其二，处理组与对照组都加一标准的断裂剂，这样交联的存在就会减少后者所致的DNA断片释放，与对照组相比“彗星”尾部减少的长度等指标与交联的量成正比。但是如所用射线引起的DNA交联少而断裂多，则用此法不太实际。因为射线所致的DNA 链断裂会产生一个很高的“彗星”背景而不利于判断［4］。
有实验研究发现小牛胸腺脱氧核糖核蛋白（DNP）在uv或γ射线照射以后，其中DNA中不能被提取的部分随着照射剂量的增加而增加，但用胰蛋白酶处理，则观察不到这部分DNA。因为uv和γ射线照射导致了DNA和核蛋白交联，影响了DNP中DNA的提出，胰蛋白酶能裂解DNA与蛋白质之间的共价健，消化DNP中的蛋白质部分，所以全部的DNA都能被提出。故SCGE测定DPC是根据加入蛋白酶前后DNA迁移距离的变化来计算交联率，从而对射线引起DPC的能力进行评价。Marty等［7］用SCGE研究p53基因对细胞增殖作用时发现p53缺陷型小鼠精子细胞DNA断裂数目远低于野生型，推测可能由于p53基因缺陷引起DNA交联。
uv能形成较多的DNA链内交联（嘧啶二聚体形成）。细胞内源性酶对损伤DNA灶进行切除及再连接修复，与此过程相吻合的是在SCGE中可相应的观察到“彗尾”的出现与消失。当然DNA链被切开后再连接的速度非常快，故在加入核酸内切酶的同时加入抑制剂或使DNTPs漏出胞核，以阻断切除修复中DNA合成与再连接，这才可检测到DNA的细微损伤。例如用t4-uv特异性核酸内切酶可监测嘧啶二体的切除。
1．2细胞死亡的检测放射治疗中，如果辐射引起的DNA双链断裂等得不到修复，则细胞最终走向凋亡或坏死。凋亡细胞的特征性改变为核酸内切酶在核小体间将DNA分裂成核小体大小（180～200 bp）或其倍数的碎片。在SCGE电泳过程中DNA迁移距离数倍于正常细胞［8］。因大量的DNA断片迁移形成脱离“彗头”的巨大“彗尾”，二者很容易区分。因不需要再经历变性，中性SCGE和碱性SCGE均适用。可用于快速检测凋亡细胞的比例及DNA断片的大小，因此在样本量少时SCGE是代替流式细胞仪检测凋亡的好方法。坏死细胞DNA断片大小虽不规则，但在电场的作用下亦可形成巨大“彗尾”，容易与正常细胞鉴别，但很难与凋亡细胞区分。
1．3预测放射敏感性以往常用于预测肿瘤放射敏感性的技术主要是存活曲线，但早期的存活曲线在初始部分（剂量小于3 Gy）时不够敏感，而这部分在放疗上却是最重要的，“彗星”法可检出低至01 Gy的辐射损伤，因此可以弥补这点不足，还可以在低剂量阶段解决肿瘤的辐射异质性问题。故可以通过在放疗前先取活组织标本在体外放疗2 Gy，用SCGE法测出DNA损伤程度，再在 37*!℃ 孵育测得其修复损伤的能力而该肿瘤对射线的敏感性。为临床选择治疗方法提供依据。
1．31乏氧分数的测定因为氧具有很强的电子亲和力，故在放射治疗中起着亲电子性增敏剂的作用。射线在氧合好的细胞中产生的DNA损伤3～4倍于乏氧细胞。故可以用“彗星”法测出放疗以后乏氧尾矩与有氧尾矩之比，得出乏氧分数。Olive等［９］发现以肿瘤治愈为终点指标与用“彗星”法测得的乏氧分数有良好的相关性。他们同时用此法检测了73例姑息放疗的转移性肿瘤，其乏氧分数波动在000至067，平均015。并比较了现有的几种测乏氧细胞的方法，提示“彗星”法是测中央氧压<10 mmHg的肿瘤乏氧分数最敏感的方法［10］。但它的缺陷是要求在照后快速取材，否则单链修复会影响结果。且不能在治疗前测得乏氧分数。
1．32细胞的内在敏感性影响内在敏感性的主要因素是细胞修复DNA 损伤的能力不同。SCGE检测DNA修复能力的原理在于：细胞经受试物作用以后进行孵育（DNA进行修复），比较孵育前后DNA 迁移的变化可得出DNA的修复能力。这方面已有大量的文献报道。吕长兴等［11］用碱性SCGE测出鼻咽癌高分化鳞癌细胞系比肺腺癌细胞系半修复时间长，这与CNE-1对放疗更敏感（D0值小）有较好的对应关系；Olive等［12］测得人淋巴细胞TK6与鼠的L178Y-R细胞比CHO，V79修复明显减慢而出现较多的残余损伤，从而认为TK6与L178Y-R细胞系存在修复缺陷。故SCGE法可发现修复缺陷细胞系，预测不同肿瘤的修复能力。大量实验提示乳腺癌患者“彗星”法测得的成纤维细胞和淋巴细胞DNA损伤与修复能力和临床皮肤放射反应存在良好的相关性［13,14］。与以往的检测DNA修复实验如：核酸探针法、病毒探针法比较，具有简单、快速、灵敏和不需同位素标记等优点。
1．33细胞周期在“彗星”检测中，由于荧光染料与DNA 的结合是特异的，根据荧光强度可以对DNA进行定量，从而鉴别不同周期、不同倍体的细胞。以往的一系列检测均未能测得处于不同细胞周期的细胞对同一处理存在DNA链断裂发生和重接率的差异。Olive等［12］用碱“彗星”分析DNA 损伤和细胞周期位置发现，测量单链断裂的“彗尾”和半修复时间因细胞所处的细胞周期不同而不同。G1期的细胞半修复时间(37　s)较其他期细胞(51 s)短，故认为“彗星”法能检测出处于不同周期的细胞对射线修复能力的细小变化。S期的细胞用“彗星”法检测链断裂的敏感性均较其他期低，这是因为复制产生的问题。S期DNA复制时形成的复制叉在碱性裂解液或电泳液时形成单链断裂，所以增加了S期细胞的损伤背景。
134低剂量放射超敏感性的预测低剂量超敏感性即有些细胞在受到<50 cGy照射存在敏感性增高的现象，这使得靶区外正常组织的生物效应将高于以前的预测值。因传统的克隆记数法不能评价<100 cGy的肩区的存活变化，而SCGE具有高度敏感性，故可用于探测此现象。以便常规照射或三维适形放射治疗时，尽量考虑野外正常组织的低剂量超敏问题以避免出现较严重的损伤。
由于“彗星”法能检测出上述影响放射敏感性的因素，从而鉴别对射线敏感或抗拒的亚细胞群在放射生物学领域有重要的应用价值。近年来随着ATM，KU，XRCC等DNA修复相关基因功能的阐明，通过此途径修饰细胞的辐射敏感性成为可能，而SCGE成为不可缺少的检测工具。
14探讨辐射致突变、致癌、致死效应的机制由于SCGE可灵敏的检测出各种DNA损伤与修复，故可用于探讨辐射致突变、致癌、致死效应具体是因为DNA双链断裂、断链重接失真，还是因为碱基损伤或链间交联等引起。用SCGE检测着色性干皮病（XP）患者经uv照射后的淋巴细胞时，发现其“彗星”细胞百分率较正常人淋巴细胞经uv照射后明显减少，提示切除修复中被切开的DNA链减少。是核酸内外切酶存在缺陷。毛细血管扩张性共济失调（AT）患者却对电离辐射的敏感性比正常人大3～4倍。最近用SCGE证实AT细胞除了缺乏细胞周期控制，它修复双链的能力也甚微［15］，并且很不精确，DNA分子游离端重接率很差，这就提示遗传重组方面有短缺。范康尼贫血症（FA）为一常染色体隐性遗传病。Djuzenova等［16］报道不同的实验室独立测得的FA及FA携带者DNA初始损伤的尾力矩都明显增高，且30～50 min残余损伤和半修复时间较正常人明显增高。
2小结
在放射生物学领域，SCGE已非常广泛用于各种辐射损伤的检测、放射敏感性的预测、辐射致癌致畸致突机制的探讨、辐射修饰剂的评价等多个方面，均显示了快速、简便、灵敏等显著的优越性。随着计算机图像分析系统的完善及某些标准的统一，SCGE技术将成为放射生物学研究必不可少的检测工具之一。
参考文献
1Osting O, Johanson KJ.  Microeletronphoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian.  Biochem Biophys Res Commun,1984,123:291
2Singh NP, McCOY MT, Tice RR, et al.  A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.  Exp Cell Res， 1988,175:184
3郑履康,宋博. 单细胞凝胶电泳技术的应用与发展. 中国职业医学,2002,7（6）:45
4Olive PL.  DNA damage and repair in individual cells:application of the comey assay in radiobiology.  Inj J Radiat Biol，  1999， 75(4):395
5洪承皎,王静. 应用单细胞凝胶电泳测辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤. 中国工业医学杂志,1999,12（6）:346
6Olive PL.  Detection of hypoxia by measurement of DNA damage in individual cells from spheroids and murine tumours exposed to bioreductive drugs: I Tirapazamine.  Br J Cancer, 1995,71:529
7Marty MS, Singh NP, Holsapple MP, et al.  Influence of P53 iygosity on select sperm parameters of the mouse.  Mut Res,1999,427(1):39
   8Arends MJ, Morris RG, Wyllie AH, et al.  Apoptosis:the role of the endonuclease.  Am J Pathol,1990,136:593
9Olive PL, Durand R, Jackson SM, et al.  The comet assay in clinic practice.  Acta Oncologica, 1999, 38(7): 839
10Ravanagh MC, Tsang V, Chow S, et al.  A comparison in individual marine tumours of techniques for measuring oxygen levels.  Int J Radiat Oncol Biol Phys,1999,44(5):1137
11吕长兴,杨伟志,殷蔚伯. “彗星”法分析人肿瘤细胞DNA放射损伤和修复. 中华放射肿瘤学杂志, 2000, 9(2)：114
12Olive PL, Banath JP.  Induction and rejoining of radiation-induced DNA single-strand breaks: “tail moment" as a function of position in the cell cycle.  Mut Res,1993,294:275
13Popanda O, Ebbeler R, Twardena D, et al.  Radiation-induced DNA damage and repair in lymphocytes from breast cancer patients and their correlation with acute skin,reaction to radiotherapy.  Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2003, 1255(5): 1216
14Popanda O, Ebbeler R, Twardena D, et al.  Radiation-induced DNA damage and repair in lymphocytes of breast cancer patients in comparison with acute skin reactions after radiation therapy.  Environmental and Molecular Mutagenesis, 2002, 39(Suppl): 50
15Oppitz U, Denzinger S, Nachtrab U, et al.  Radiation-induced comet-formation in human skin fibroblasts from radiotherapy patients with different normal tissue reactions.  Strahlenth & Oncol, 1999,175(7): 341
16Djuzenova CS, Rothfuss A, Oppitz U, et al.  Respons to X-irradiation of Fanconi anemia (FA) homozygous and heterozygous Qlls assessed by the single cell gel electrophoresis.  Laboratory Investigation,2001, 81(2):105
(收稿日期：2003-05-28)