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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于PCR扩不出的问题,求大神解答已有5人参与

大家好:我现在PCR的时候遇到了一个问题,我根据小麦转录组测序的结果,想设计几对引物做荧光定量,扩增长度大约100bp左右。但是,我想先用基因组DNA,用普通的PCR仪摸一下条件,却怎么也扩不出目的带(只有模糊的引物带),用touchdown程序也不行。用cDNA直接荧光定量更是定不出来,可我设计引物的时候都尽量避开了引物二聚体或者错配,这是咋回事啊?求大神解答,着急啊
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 冰封之real at 2014-01-26 09:29:32
既然是小麦基因组,那LZ就得考虑内含子的问题,要试也不能拿基因组试,而是用cDNA进行普通PCR,如果能得到所需条带,再上荧光定量PCR。如果得不到,那就是引物有问题(也有可能是cDNA有问题,不过这个可能性不大)

好吧,我用cDNA试试,不过有的引物cDNA扩增也不理想,谢谢你。
11楼2014-01-28 15:56:07
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若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-01-24 16:11:08
我觉得你可以先用通用引物进行PCR,以确认模板没有问题,如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题
没有比脚更长的路,没有比人更高的山
2楼2014-01-24 15:46:37
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

我的序列来自转录组测序,只是部分的mRNA序列,我是根据这个序列设计的。还有,怎么用通用引物PCR?
3楼2014-01-24 19:04:10
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 若溪 at 2014-01-24 15:46:37
我觉得你可以先用通用引物进行PCR,以确认模板没有问题,如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题

我的序列来自转录组测序,只是部分的mRNA序列,我是根据这个序列设计的。还有,怎么用通用引物PCR?
4楼2014-01-24 19:04:39
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