| 查看: 3888 | 回复: 15 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
NanHao1991铜虫 (初入文坛)
|
[求助]
MBP融合表达蛋白通过Amylose Resin之后纯化效率不佳 已有4人参与
|
|
|
在pMAL载体上加了一段目标序列，表达的蛋白为：MBP-目标蛋白。 表达条件为18℃*250rpm*12h，IPTG终浓度为0.3mM. 而后，利用NEB公司的Amylose Resin纯化，共进行过两次过柱实验。 1st，完全按照说明书进行，洗脱的maltose buffer终浓度为10mM。 结果： 1）60%-70%的融合蛋白存在于过柱穿流液中； 2）杂蛋白冲洗充分的情况下，利用10 mM maltose buffer洗脱，仍会洗下杂蛋白。 2nd，其他条件不变，配制1mM, 2mM, 5mM, 10mM的maltose buffer，进行梯度洗脱。 结果：1mM的buffer冲下了大部分融合蛋白和杂蛋白。剩下的buffer也能洗下杂蛋白和融合蛋白。起不到纯化效果。 分析：带有MBP标签的蛋白，极易与maltose结合，以至于低浓度maltose buffer也能将杂蛋白和融合蛋白一起洗下。 求教： 1）如何提高MBP-目标蛋白的挂住效率； 2）本人因后续试验需要较纯的MBP-目标蛋白，MBP标签纯化时候如何优化以得到纯的蛋白？ 补充说明： 我的目标蛋白之前用过His tag，GST tag，在原核表达系统（BL21）和真核表达系统(sf9)中都表达过，目标蛋白总是包涵体，western检测可溶性蛋白几乎为零，所以现在在用MBP标签表达,希望该蛋白能够溶解。 研一学生，第一次做MBP表达，实验室也没人用过MBP标签，烦请大家指教！ 以上，万分感谢。 |
回复此楼» 猜你喜欢
有多少人是今天查系统知道结果的？
已经有19人回复
-
面上合作单位盖章
已经有9人回复
-
面上函评意见出来了，像什么等级？
已经有17人回复
-
为什么国自然不能直接公布
已经有5人回复
-
梦想
已经有7人回复
-
学科评审组评审是指会评吗？
已经有4人回复
-
为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难
已经有14人回复
-
小白求助 投论文要求的highlights应该如何写
已经有4人回复
-
麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上）
已经有12人回复
-
怎么看青基中了没有啊
已经有6人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 融合蛋白不挂柱，急！
已经有7人回复
- 【求助/交流】MBP融合蛋白的Amylose亲和层析
已经有11人回复
4楼2014-02-04 17:53:46
NanHao1991
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 194.5
- 帖子: 30
- 在线: 37.9小时
- 虫号: 2227738
- 注册: 2013-01-07
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
2楼2014-01-24 09:40:32
3楼2014-01-26 23:25:15
会思想的芦苇
金虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 1415.8
- 红花: 2
- 帖子: 360
- 在线: 166.2小时
- 虫号: 1360621
- 注册: 2011-08-04
- 专业: 生物技术药物
5楼2014-02-07 08:46:10
投票:
20