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NanHao1991铜虫 (初入文坛)
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[求助]
MBP融合表达蛋白通过Amylose Resin之后纯化效率不佳 已有4人参与
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在pMAL载体上加了一段目标序列，表达的蛋白为：MBP-目标蛋白。 表达条件为18℃*250rpm*12h，IPTG终浓度为0.3mM. 而后，利用NEB公司的Amylose Resin纯化，共进行过两次过柱实验。 1st，完全按照说明书进行，洗脱的maltose buffer终浓度为10mM。 结果： 1）60%-70%的融合蛋白存在于过柱穿流液中； 2）杂蛋白冲洗充分的情况下，利用10 mM maltose buffer洗脱，仍会洗下杂蛋白。 2nd，其他条件不变，配制1mM, 2mM, 5mM, 10mM的maltose buffer，进行梯度洗脱。 结果：1mM的buffer冲下了大部分融合蛋白和杂蛋白。剩下的buffer也能洗下杂蛋白和融合蛋白。起不到纯化效果。 分析：带有MBP标签的蛋白，极易与maltose结合，以至于低浓度maltose buffer也能将杂蛋白和融合蛋白一起洗下。 求教： 1）如何提高MBP-目标蛋白的挂住效率； 2）本人因后续试验需要较纯的MBP-目标蛋白，MBP标签纯化时候如何优化以得到纯的蛋白？ 补充说明： 我的目标蛋白之前用过His tag，GST tag，在原核表达系统（BL21）和真核表达系统(sf9)中都表达过，目标蛋白总是包涵体，western检测可溶性蛋白几乎为零，所以现在在用MBP标签表达,希望该蛋白能够溶解。 研一学生，第一次做MBP表达，实验室也没人用过MBP标签，烦请大家指教！ 以上，万分感谢。 |
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