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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » MBP融合表达蛋白通过Amylose Resin之后纯化效率不佳
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NanHao1991

铜虫 (初入文坛)

[求助] MBP融合表达蛋白通过Amylose Resin之后纯化效率不佳 已有4人参与

在pMAL载体上加了一段目标序列，表达的蛋白为：MBP-目标蛋白。
表达条件为18℃*250rpm*12h，IPTG终浓度为0.3mM.
而后，利用NEB公司的Amylose Resin纯化，共进行过两次过柱实验。
1st，完全按照说明书进行，洗脱的maltose buffer终浓度为10mM。
结果：
1）60%-70%的融合蛋白存在于过柱穿流液中；
2）杂蛋白冲洗充分的情况下，利用10 mM maltose buffer洗脱，仍会洗下杂蛋白。

2nd，其他条件不变，配制1mM, 2mM, 5mM, 10mM的maltose buffer，进行梯度洗脱。
结果：1mM的buffer冲下了大部分融合蛋白和杂蛋白。剩下的buffer也能洗下杂蛋白和融合蛋白。起不到纯化效果。
分析：带有MBP标签的蛋白，极易与maltose结合，以至于低浓度maltose buffer也能将杂蛋白和融合蛋白一起洗下。

求教：
1）如何提高MBP-目标蛋白的挂住效率；
2）本人因后续试验需要较纯的MBP-目标蛋白，MBP标签纯化时候如何优化以得到纯的蛋白？

补充说明：
我的目标蛋白之前用过His tag，GST tag，在原核表达系统（BL21）和真核表达系统(sf9)中都表达过，目标蛋白总是包涵体，western检测可溶性蛋白几乎为零，所以现在在用MBP标签表达,希望该蛋白能够溶解。

研一学生，第一次做MBP表达，实验室也没人用过MBP标签，烦请大家指教！
以上，万分感谢。
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Talentisenduring***
1楼 2014-01-23 12:55:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

joyva

银虫 (小有名气)
最近也碰到同样的问题，头都大了，之前形成包涵体，连MBP总算可溶解了，可是挂Amylose Resin效率低，可能还是和目的蛋白有关吧。你有做MBP对照吗？
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人生没有彩排，珍惜每一天！
3楼2014-01-26 23:25:15
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普通回帖

NanHao1991

铜虫 (初入文坛)
为什么没有人回答这个问题。。。
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Talentisenduring***
2楼2014-01-24 09:40:32
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547star

木虫 (著名写手)
不懂。不过，楼主可以考虑在C端加6xHis之类的标签。
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为什么
4楼2014-02-04 17:53:46
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会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

稀释样品  降低流速 增加保留时间
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5楼2014-02-07 08:46:10
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NanHao1991

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by joyva at 2014-01-26 23:25:15
最近也碰到同样的问题，头都大了，之前形成包涵体，连MBP总算可溶解了，可是挂Amylose Resin效率低，可能还是和目的蛋白有关吧。你有做MBP对照吗？

做对照了，也是这个趋势。回家过年了，现在开始奋战，做出来了告诉你啊，你要是做出来也拜托指教指教~~
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Talentisenduring***
6楼2014-02-11 22:53:01
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NanHao1991

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 547star at 2014-02-04 17:53:46
不懂。不过，楼主可以考虑在C端加6xHis之类的标签。

恩恩，已经做过HIS的了，蛋白直接沉淀了。多谢啦~~
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Talentisenduring***
7楼2014-02-11 22:54:12
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NanHao1991

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 会思想的芦苇 at 2014-02-07 08:46:10
稀释样品  降低流速 增加保留时间

我的过珠速度还比较正常，穿流液过柱3次。我估计还是蛋白表达的问题。。。过柱时间太长是不是也不好呀？
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Talentisenduring***
8楼2014-02-11 22:55:55
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547star

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by NanHao1991 at 2014-02-11 22:54:12
恩恩，已经做过HIS的了，蛋白直接沉淀了。多谢啦~~...

我的意思是N端加MBP，C端加HIS，做了吗？
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为什么
9楼2014-02-12 11:59:29
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化学521

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by NanHao1991 at 2014-02-11 22:54:12
恩恩，已经做过HIS的了，蛋白直接沉淀了。多谢啦~~...

加HIs你用的是什么柱子纯化的
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10楼2014-08-18 21:08:42
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