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laisforever

银虫 (小有名气)

[求助] 引物设计 已有4人参与

小妹现在在做质粒构建方向，现在涉及引物序列的问题，引物要求有引物+酶切位点+无用序列，
我就想问一下无用序列，它代表什么，是统一的吗？希望大虾指导一下
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人生在世，俯仰之间，唯有追求卓越，但求尽其所能.
1楼 2014-01-09 15:10:15
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guojndx

金虫 (小有名气)

生物催化小虫

【答案】应助回帖

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laisforever: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-01-10 13:06:45
你说的无用序列是保护碱基吧，保护碱基一般是三个以上，以保证PCR产物酶切的正常进行，具体没有特定的序列要求，但要保证不能与引物其他位置形成发夹结构。也有人做了不同酶切位点的保护碱基表，这个网上可以下载，希望对你有所帮助。
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2楼2014-01-09 15:41:57
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

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无用序列就是保护碱基，双链DNA末端不是良好的双螺旋结构，多少会散开一点。设计保护碱基是为了使酶切位点处于DNA靠里一点的位置而形成好一点的DNA双螺旋结构，进而提高酶切效率。

如果不设计保护碱基，酶切效率会降低，有时甚至切不开。

至于用什么样的保护碱基，要看你用什么样的酶切位点。不同的酶切位点用不同的保护碱基，网上都能下到的。
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3楼2014-01-09 15:45:15
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

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laisforever: 金币+2, ★★★很有帮助, 保护碱基的前后必须是相匹配的吗？就像AGT-酶切位点-ACT，要这样嘛，还是前后可以随意 2014-01-10 13:05:58
你所谓的无用碱基可能是保护碱基，为了保证内切酶正常切割所加的序列，设计一般没有太严格要求，我们实验室一般根据GC含量加上5个碱基。有人也试过不加，效果也可以。
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hehe
4楼2014-01-09 16:10:52
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liushicai226

金虫 (小有名气)

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无用序列是是保护碱基，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断，必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断，具体什么样的酶切位点加什么碱基，这有个酶切位点保护碱基表，可以参考一下。
祝实验顺利！
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用执着，敲开梦想的大门
5楼2014-01-10 10:22:59
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liushicai226

金虫 (小有名气)
无用序列是是保护碱基，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断，必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断，具体什么样的酶切位点加什么碱基，这有个酶切位点保护碱基表，可以参考一下。
祝实验顺利！
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    • 2014-01-10 10:25:35, 44 K

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laisforever
用执着，敲开梦想的大门
6楼2014-01-10 10:25:46
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laisforever

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by liushicai226 at 2014-01-10 10:25:46
无用序列是是保护碱基，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断，必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断，具体什么样的酶切位点加什么碱基，这有个酶切位点保护碱基 ...

非常感谢，对我很有帮助，谢谢
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人生在世，俯仰之间，唯有追求卓越，但求尽其所能.
7楼2014-01-10 13:01:42
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chtywlzh

铜虫 (初入文坛)
我也在头疼引物的设计问题，赶紧好好学学看
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8楼2014-01-10 17:27:34
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