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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于TAKARA的RT-PCR试剂盒说明书~
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liangpz

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于TAKARA的RT-PCR试剂盒说明书~ 已有3人参与

最近买了TAKARA的RT-PCR试剂盒，RR014A，说明书倒是很详细，但还是有地方不太明白，希望有用过的前辈指点指点啊~~

1  反转录前有个变性退火的过程，65℃    5 min，接着有个4℃，但没说多长时间，是怎么个意思呢？加了反转录酶后的延伸部分也有
同样的问题，只有4℃，没有多长时间~

2  试剂盒里面带的三个反转录引物，Oligo dT Primer，Random 6 mers和Specific Primer，做未知基因的话，前两个之中哪个好一点呢？

3  还有就是PCR部分说明书上写了两步法和三步法，这又是怎么回事？一般不是只有一步法和两步法吗，三步法是什么意思？
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1楼 2013-12-27 21:38:57
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sk1981521

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

TAKARA 试剂盒的说明书官网上就有
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11楼2015-08-13 22:17:19
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liangpz: 金币+8, ★★★★★最佳答案 2013-12-28 09:52:14
myprayer: 金币+5, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-28 11:42:55
1.4℃是产物保存的温度，4℃前的反应已经结束啦，可以收了。仪器上4℃这步你可以设成无穷大，或者24小时之类的，万一没有及时收，产物在4℃下也能存很久。
2. Specific Primer是针对已知基因专门设计的，试剂盒上应该是没有的哦。 你的是未知基因，Oligo dT Primer和Random 6 mers建议一起用，更容易获得全长的RNA。
3.“PCR部分说明书上写了两步法和三步法”这个是针对PCR程序说的。这里的两步是指退火和延伸用同一个温度，三步则是传统PCR的变性、退火、延伸都用不同温度。两步法因为不用变化温度，PCR耗时相对较短；三步法则可以有效提高反应的特异性和扩增效率。时间充裕的话还是用三步法吧。

你说的一步法和两步法指的是反转录和定量PCR这两个过程是不是在一起。通俗地说，如果你先做反转录，然后取cDNA出来再做定量PCR，这个叫做两步法；如果你一次性把反转录和定量PCR的东西都加到一个管子里，反转录之后不开盖，直接做定量PCR，这个叫做一步法（不是所有试剂盒都能用一步法的哈，不清楚时别乱来）。一步法比较省事，而且不开盖可以降低污染几率，但是反转录出来的cDNA只能用一次，适合土豪；两步法的话比较省东西，得到的cDNA可以多次使用。我建议你用两步法。
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2楼2013-12-27 22:21:48
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2013-12-27 22:21:48
1.4℃是产物保存的温度，4℃前的反应已经结束啦，可以收了。仪器上4℃这步你可以设成无穷大，或者24小时之类的，万一没有及时收，产物在4℃下也能存很久。
2. Specific Primer是针对已知基因专门设计的，试剂盒上应 ...

大侠 我用的逆转录试剂盒是TAKARA的 DRR025A 我用的是两步法，有个问题想要请教一下在第一步逆转录的时候  有1.30℃ 10min 2.42-50 50-30min  5℃ 5min 请问一下 第1点的30℃ 30Min是做什么用的？第2步的温度是延伸温度么？
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生命不息奋斗不止
3楼2013-12-27 22:50:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-28 20:53:53
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2013-12-27 22:50:04
大侠 我用的逆转录试剂盒是TAKARA的 DRR025A 我用的是两步法，有个问题想要请教一下在第一步逆转录的时候  有1.30℃ 10min 2.42-50 50-30min  5℃ 5min 请问一下 第1点的30℃ 30Min是做什么用的？第2步的温度是延伸 ...

对于原核RNA样品，一般有室温25°C 5-10分钟这一步，而真核RNA样品，一般加酶之前最好对模板进行预变性,70°C左右吧，不同盒子会有些不同。这一步是让模板处于正确状态便于逆转录酶工作的。第二步通常是逆转录酶工作的温度，通常是42°C。之后应该有一步逆转录酶失活，通常是85°C左右，然后降温至4°C。
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4楼2013-12-28 07:09:30
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